肝豆状核变性患者FBN1基因甲基化及蛋白表达水平与临床病理特征的相关性研究

肝豆状核变性又称威尔逊氏病，是铜的转运基因ATP7B发生突变导致铜的转运和排泄出现障碍，进而造成的一种常染色体隐性遗传性疾病

。肝豆状核变性的主要临床表现为肝损伤及神经系统损伤，严重影响人们的生活质量，同时对生命安全也造成一定的威胁

。原纤维蛋白-1(fibrillin-1，FBN1)基因编码的FBN1蛋白是微原纤维的主要成分，它是一种结构蛋白，与纤维化程度有关

。而肝纤维化几乎是所有肝豆状核变性患者肝脏的主要病理改变，推测FBN1可能与肝豆状核变性的病理改变有关

。虽然FBN1基因甲基化在癌症中的研究较多

，但关于FBN1基因甲基化及蛋白表达水平与肝豆状核变性间的关系仍需进一步探究。因此，本研究通过探讨FBN1基因甲基化及蛋白表达水平与肝豆状核变性患者临床病理特征及预后的关系，以期为肝豆状核变性的临床诊断及治疗提供新靶点和依据。

1 资料与方法

选取重庆市黔江中心医院和四川大学华西医院2013年2月至2016年2月收治的79例肝豆状核变性患者肝病变组织为研究对象(肝豆状核变性组)，年龄(45.28±13.46)岁(20～76岁)，男47例，女32例。选取其肝脏正常组织作为正常对照组。另收集患者肝豆状核变性家族史、病程及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)、尿铜(urine copper，u-Cu)水平等基线资料。

纳入标准：(1)经影像学检查、临床特征及组织病理证实确诊为肝豆状核变性患者，符合肝豆状核变性诊断标准

；(2)病历资料齐全者；(3)患者均自愿参加并签署知情同意书；(4)术前未接受过其他辅助治疗。排除标准：(1)合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤者；(2)有严重精神障碍者；(3)妊娠期或哺乳期妇女；(4)伴有其他肝脏疾病者。本研究经重庆市黔江中心医院临床研究伦理委员会批准(批号：Lw2012011)。

优先选取连接乡、镇、大村庄之间的道路，通往高等级道路、车站、码头、矿山的道路，作为行政界线的道路，穿越国境线的道路以及连接水源的道路。一般应使乡镇级居民地有道路通往、居民地与主要地物之间均有道路连接。两居民地之间有数条道路相连接时，应优先选取等级较高、距离较短的道路[2]。

PCR仪(型号：MA-1600)购自中国雅睿生物。CpGenome DNA Modification Kit(货号：XY-S7821)购自德国Merck Millipore公司；DNA抽提试剂盒(货号：JL1545)购自德国QIAGEN公司；DAB显色试剂盒(货号：DA1010)购自上海吉至生化科技有限公司；FBN1抗体(货号：ATA29131)购自武汉益普生物科技有限公司；PTG19-T载体(货号：SWFZ022)购自上海信帆生物科技有限公司；XL-10 Gold感受态细胞(货号：CM-6013K)购自上海淳麦生物科技有限公司。

肝豆状核变性组FBN1蛋白阳性表达率(70.89%)显著高于正常对照组(13.92%)，差异有统计学意义(

<0.05)(见表3、图2)。

研究区15年来年均RUE总体呈下降趋势，年均下降 0.000 1。RUE最高值出现在 2002年，为0.016 18，最低值出现在2012年。从各县来看，除若尔盖县以外，其他各县最高值均出现在2002年。由表1可以得到，各县RUE线性趋势均为负值，其中石渠县RUE下降最快，为研究区平均下降速度的两倍，壤塘县与甘孜县下降速度最慢，其他4个县下降速度近于研究区RUE下降的速度。

1.3.3 FBN1蛋白表达水平检测：采用免疫组织化学法检测肝组织FBN1蛋白表达水平，常规操作(一抗为FBN1抗体)后采取半定量法进行评分

。双盲法进行结果判定，随机选10个高倍镜视野(200倍)观察，取每个标本两次观察评分的平均值。首先按染色强度计分：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，无色为0分；之后按阳性细胞率计分，阳性细胞百分数≥76%、51%～75%、26%～50%、6%～25%、≤5%分别判定为4、3、2、1、0分。上述两种得分相乘，总分<4分为阴性(-)，≥4分为阳性(+)。

肝移植手术后5年内采用电话、入户和门诊等方式进行随访，术后第1～3年平均每3～6个月随访1次，之后每半年随访1次。其生存期从手术之日起计算。

1.3.1 样品采集及保存：采集患者肝移植术中病变肝组织及其肝脏正常组织，部分置于-80 ℃保存；部分经10%甲醛固定后，进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋及切片(厚度4 μm)。肝豆状核变性患者肝脏病理表现：早期肝细胞呈小、大泡混合性脂变，肝小叶未见明显炎症(见图1)。

1.3.2 FBN1基因甲基化测定：DNA抽提试剂盒提取受试者肝组织基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度后-20 ℃保存。采用亚硫酸氢钠修饰试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，75 ℃ 40 s，40个循环。PCR反应体系：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，2×PCR Mix 25 μl，ddH

O 21 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl。目标片段割胶回收后连接，PTG19-T做载体，采用XL-10 Gold感受态细胞进行转化、复苏、涂板，酶切法鉴定阳性菌落，测序后甲基化数据用BIQ Analyzer软件分析和整理。FBN1甲基化与非甲基化引物序列如表1所示，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

与此同时，还不断加大了全县77个探矿权的科学规范管理，与河南省地质调查院等22个地勘单位建立了合作关系。全县不仅又探明钼金属233万t，而且还新探明白钨59万t，铅锌126万t，黄金74万t，为本县的矿产资源可持续发展提供了充分的资源保障。

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计数资料以例数/%表示，组间比较行

检验及Fisher精确检验；采用Kaplan-Meier法分析肝豆状核变性患者FBN1基因甲基化及蛋白表达水平与预后的关系，采用Log-rank进行生存曲线显著性检验，以

=0.05为检验水准；采用多因素Cox回归分析影响肝豆状核变性患者预后的因素。

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

随访5年，79例肝豆状核变性患者中死亡18例、生存61例。用Kaplan-Meier法分析FBN1基因甲基化及蛋白表达水平与肝豆状核变性患者5年生存率的关系，结果显示FBN1蛋白阳性表达肝豆状核变性患者5年生存率(69.64%)低于FBN1蛋白阴性表达患者(95.65%)，差异有统计学意义(

=6.269，

<0.05)；FBN1基因甲基化肝豆状核变性患者5年生存率(95.24%)高于FBN1基因非甲基化患者(70.69%)，差异有统计学意义(

=5.281，

<0.05)(见图3～4)。

5.并购价值的效应体现。一个是效益效应，据某些资料显示，对于双方融资成立的新公司，首次融资已经超33亿元，融资后公司的估值可超180亿元，这是全球范围最大的私募融资之一，这有利于新企业在未来的时间内上市。两家的合并重构使得用户数量急剧上升，覆盖的群体范围以及地域范围也扩大。新公司覆盖了超过2800个县、市、区，日订单量突破1000万单，移动端月度活跃用户超1.5 亿人，年购买用户近2亿人，2015年总交易额超过1700亿元人民币。另一个是战略效应，对于企业来说，拿下O2O市场，就有在互联网领域的主动权，未来发展的潜力不可限量，美团与大众点评的战略整合，两家企业优势互补，有利于公司的长远发展。

根据肝豆状核变性患者FBN1基因甲基化及其蛋白表达情况，将其分为FBN1非甲基化组58例，FBN1甲基化组21例；FBN1蛋白阴性组23例，FBN1蛋白阳性组56例。FBN1基因甲基化及蛋白表达与性别、病程及AST、ALT水平无相关性(

>0.05)；FBN1基因甲基化及蛋白表达与年龄、肝豆状核变性家族史以及CP、u-Cu水平有相关性(

<0.05)(见表4)。

肝豆状核变性组FBN1基因甲基化率(26.58%)显著低于正常对照组(63.29%)，差异有统计学意义(

<0.05)(见表2)。

将肝豆状核变性患者是否发生死亡作为因变量，以患者FBN1基因甲基化、FBN1蛋白阳性表达、年龄、肝豆状核变性家族史、CP、u-Cu为自变量进行多因素Cox回归分析，结果显示，FBN1蛋白阳性表达是影响肝豆状核变性患者死亡的独立危险因素(

<0.05)，FBN1基因甲基化是影响肝豆状核变性患者死亡的保护因素(

<0.05)(见表5)。

3 讨论

肝豆状核变性临床症状差异较大，无法通过任何一项或几项指标确诊或排除，极易出现误诊、漏诊等

。肝豆状核变性患者体内铜排泄出现障碍，在脑、肾、肝等器官处蓄积同时导致相应病变，进而造成患者病情加重，治疗效果较差

。近年来分子生物医学快速发展，然而目前关于肝豆状核变性生物标志物的研究较少。因此，寻找切实有效的肝豆状核变性生物标志物显得尤为重要。

兰江大桥高高地矗立着。蒋大伟把车开到路边，两人仰头看着大桥。桥上，车辆在不停地穿梭流动。蒋大伟低声地：这就是兰江大桥！郑馨默默看着大桥，没有说话。蒋大伟继续说道：我没说错吧，兰江大桥很有气势，很美。郑馨还是没说话，她打开车门，蒋大伟：就这么下车了，不想再说点什么吗？郑馨仍然没说话，蒋大伟急了：等等！临死之前，还有什么未了之事，或许我能再帮你个忙。郑馨皱紧眉头，像竭力想着什么。蒋大伟说：反正是快死的人了，没什么不好说的。郑馨想了想，咬牙切齿地：我想等陈晓来，让他看看我是怎么死的！

目前研究表明，表观遗传的重要组成部分为DNA甲基化驱动转录调控，DNA甲基化是一些功能基因沉默或失活的常见机制

。因此，基因甲基化在疾病的发生发展中可发挥重要作用。FBN1基因由66个外显子组成，其编码的蛋白是一个350 ku的糖蛋白

。FBN1可参与组成弹性蛋白，而弹性蛋白是一种细胞外基质蛋白，在肝纤维化的发生发展中发挥重要作用

。Wang等

研究表明，纤维蛋白原是肝豆状核变性中的关键调节剂。本研究结果显示，肝豆状核变性组FBN1蛋白阳性表达率(70.89%)高于正常对照组(13.92%)，而肝豆状核变性组FBN1基因甲基化率(26.58%)低于正常对照组(63.29%)。提示FBN1基因启动子的低甲基化及蛋白高表达可能与肝豆状核变性的发生、发展有关。此外，本研究中FBN1基因甲基化及蛋白表达与年龄、肝豆状核变性家族史以及CP、u-Cu水平有相关性。研究表明，u-Cu升高和血清CP降低是诊断肝豆状核变性的参考依据，CP、u-Cu水平异常的患者肝功能大多异常

。推测FBN1基因低甲基化使FBN1蛋白表达水平升高，FBN1参与合成弹性蛋白的作用异常增加，使得某些胶原纤维在肝内的病理沉积过多，造成肝豆状核变性患者出现肝纤维化，进而影响肝功能。结合本研究对临床病理特征与基因甲基化及蛋白表达水平关系的分析结果，进一步推测FBN1基因低甲基化、FBN1蛋白高表达可能多发生于年龄<45岁、有肝豆状核变性家族史的肝豆状核变性患者。本研究结果中FBN1基因非甲基化及蛋白阳性表达患者5年生存率较低，且FBN1蛋白阳性表达是患者死亡的独立危险因素，FBN1基因甲基化是患者死亡的保护因素。提示FBN1基因低甲基化及蛋白高表达可能不利于肝豆状核变性患者预后，推测FBN1的低甲基化及高表达导致肝纤维化及肝功能损伤加重，肝豆状核变性患者病情加重，死亡率增加。

综上所述，FBN1基因甲基化及蛋白表达水平与肝豆状核变性患者的临床病理特征及预后关系密切，通过对FBN1基因甲基化的研究，可能对推动临床今后寻找更多的肝豆状核变性分子生物学标志物有重要作用。然而FBN1基因甲基化的检测过程中可能会出现非特异性扩增，进而造成研究结果出现偏倚，有待今后加大样本量进一步验证。

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