基于磁珠法的肉制品DNA快速提取方法研究

肖兴玉 张永哲 张凯华 陈惠杰 尹锐

摘 要：本研究建立了一种基于磁珠法的肉类DNA快速提取技术。该技术以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为裂解液，70%乙醇为漂洗液，羟基磁性微球为DNA吸附介质，从裂解液浓度、裂解时间、漂洗次数3方面进行优化。研究发现裂解液为2% CTAB、裂解时间10 min，漂洗次数2次时，基因组DNA提取效果最优。本研究建立的磁珠法肉类DNA提取技术可作为基层实验室自建肉类DNA提取方案，用于肉类DNA的快速提取，为肉类食品安全检测提供技术保障。

关键词：磁珠法;肉制品;DNA提取;CTAB

Research on Rapid DNA Extraction Method of Meat Products Based on Magnetic Bead Method

XIAO Xingyu， ZHANG Yongzhe， ZHANG Kaihua， CHEN Huijie， YIN Rui*

（College of Biological and Pharmaceutical Engineering， Jilin Agricultural Science and Technology University， Jilin 132000， China）

Abstract： This study established a rapid meat DNA extraction technology based on magnetic bead method. The technology uses sodium CTAB as the lysate， 70% ethanol as the rinse solution and hydroxyl magnetic beads as the DNA adsorption medium. It optimized in terms of the lysate concentration， lysis time and rinsing frequency. The study found that the genomic DNA extraction effect was the most optima when the lysate was 2% CTAB， the lysis time was 10 min， and the number of rinses were twice. The magnetic bead meat DNA extraction technology established in this study can be used as a self-built and internal meat DNA extraction scheme in the grass-roots laboratory for the rapid extraction of meat DNA， providing technical support for meat food safety detection.

Keywords： magnetic bead method; meat products; DNA extraction; CTAB

肉類是人们生活中重要的食物来源，一直以来肉类的食品安全受到社会和消费者的密切关注。近年来，肉类食品欺诈事件时有发生，如不法商家以低价的鸡、鸭肉冒充牛羊肉出售，以获得高额利润。这严重损害消费者的利益和破坏市场公信力[1]。同时，肉类错误标识和掺假还涉及宗教信仰问题，影响民族团结[2]。因此，对肉制品的种类和真实性进行鉴别是十分必要的。

目前，PCR方法是鉴别肉及其制品中动物源性成分的主要方法[3]。PCR检测的第一步需对样本的DNA进行提取，DNA的质量直接决定着PCR检测能否成功[4]。DNA提取方法主要有煮沸法、离心柱法、磁珠法等[5]。磁珠法具有操作简单、用时短、安全无毒和高通量的优点，受到科研人员的广泛关注。但目前的磁珠法商业试剂盒价格昂贵，一定程度上限制了它的广泛应用。本研究自建了一种简单、快速的磁珠法肉类食品DNA提取技术，该技术提取的DNA质量高，成本低廉，可用于各类实验室开展肉类DNA的快速提取，为肉类食品的身份鉴定提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡肉、牛肉、鱼肉、马肉和驴肉均购自于吉林市某大型超市，-20 ℃保存。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、氯化钠（NaCl）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）和蛋白酶K购自生工生物工程（上海）股份有限公司;动物组织DNA提取试剂盒（MagPure Tissue&Blood DNA LQ Kit）购自广州美基生物科技有限公司;异丙醇和无水乙醇购自北京索莱宝生物科技有限公司;超顺磁性硅羟基磁珠购自金准智造生物科技（吉林）有限公司。

1.2 仪器与设备

MOLCI纯水机，重庆市摩尔水处理设备有限公司;PHS-3CE pH计，上海雷磁传感器科技有限公司;PTY-224Y电子天平，华志（福建）电子科技有限公司;HWS-28水浴锅，上海一恒科技有限公司;Thermo Scientific NanoDrop One超微量紫外-可见光分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司;

1.3 主要试剂的配制

DNA裂解缓冲液：CTAB 2 g、NaCl 7.91 g、0.5 mol/L EDTA 4 mL、1 mol/L Tris 10 mL，调pH至8.0～9.0，双蒸水定容至100 mL，备用;DNA漂洗缓冲液：精密称定无水乙醇70 mL，加入30 mL双蒸水，振荡混匀，备用;DNA洗脱缓冲液：精密称定Tris base 0.121 g溶于100 mL双蒸水中，pH调至8.0，双蒸水定容至50 mL，备用。6FDA8BEF-9993-46BB-B3EF-B00D1A7FA1E9

1.4 肉类DNA的提取和提取方案的优化

1.4.1 DNA提取

称取肉类样本0.1 g，剪碎，加入1.5 mL离心管。随后，加入600 ?L裂解缓冲液和20 ?L蛋白酶K，涡旋10 s混匀;60 ℃水浴一定时间，每5 min振荡混匀。12 000 r/min离心5 min，取上清液500 ?L到1.5 mL新离心管。在新离心管中加入500 ?L异丙醇，涡旋混匀，加入15 mL磁珠涡旋混匀，静置5 min，磁力架吸附2 min，吸弃清液。向离心管中加入500 ?L漂洗缓冲液，涡旋混匀，磁力架静置2 min，吸弃废液。重复上述漂洗步骤若干次，磁力架上晾干5 min。随后，加入50 ?L洗脱缓冲液，涡旋混匀，65 ℃水浴5 min。磁力架静置5 min，吸取清液到另一个1.5 mL离心管，-20 ℃保存。

1.4.2 DNA提取方案的优化

（1）DNA裂解缓冲液浓度优化。使用牛肉样本，使用不同浓度（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%）CTAB作为DNA裂解缓冲液的主成分，以DNA质量浓度（ng/?L）和纯度（A260/A280、A260/A230）为评价指标，筛选最适浓度。筛选时，裂解时间为10 min，漂洗次数为1次。

（2）裂解时间优化。使用优化后的DNA裂解缓冲液，对样本水浴加热5 min、10 min、15 min和20 min，以DNA质量浓度（ng/?L）和纯度（A260/A280、A260/A230）为评价指标，对DNA提取最适裂解时间进行筛选。筛选时，漂洗次数为1次。

（3）漂洗次数优化。使用优化后的DNA裂解缓冲液和裂解时间，将核酸样本进行1次、2次、3次漂洗，以DNA质量浓度（ng/?L）和纯度（A260/A280、A260/A230）为评价指标，对最适漂洗次数进行优化。

1.4.3 DNA测定

采用超微量紫外-可见光分光光度计测定样品浓度和吸光度值，并记录核酸浓度、A260/A280与A260/A230的比值。

1.5 提取方法适用性验证

使用优化的DNA提取方法，对鸡肉、鱼肉、马肉和驴肉进行DNA提取，测定DNA浓度和纯度，以验证DNA提取方法的适用性。

1.6 与商业试剂盒性能的比较

使用优化后的DNA提取方法和试剂盒同时对鸡肉、马肉、驴肉进行DNA提取，从核酸提取浓度及纯度、单次核酸提取成本、提取时间3方面进行对比。

2 结果与分析

2.1 DNA提取体系优化结果

2.1.1 DNA裂解浓度优化

首先，探讨不同浓度的裂解缓冲液对肉类DNA提取结果的影响。研究表明，当裂解液主成分为2% CTAB时，即可对样本进行充分裂解，且CTAB浓度过高时，引入了过量的裂解液成分，在漂洗过程中无法被充分洗涤，导致DNA纯度下降，故选用2% CTAB作为DNA提取体系的最适裂解液，结果见表1。

2.1.2 DNA裂解时间优化

使用2% CTAB作为裂解液，对裂解时间进行优化。研究发现，60 ℃裂解10 min，即可将样本中的DNA完全释放出来，同时出于减少试验所需时间，所以将10 min作为最适裂解时间。当裂解时间为20 min时，DNA浓度出现明显下降，说明当裂解时间过长，裂解释放的DNA出现了部分降解，结果见表2。

2.1.3 漂洗次数优化

以2% CTAB作为裂解液，水浴裂解10 min，对漂洗次数进行优化，试验结果见表3。当漂洗次数为1次时，A260/A230在1.80以下，不符合相应的纯度要求。當漂洗次数为2次时，A260/A280和A260/A230均达到1.90以上，且浓度未出现大幅度下降。当漂洗次数为3次时，浓度出现了较大幅度的下降，故最优的漂洗次数为2次。

2.2 提取方法适用性验证

使用优化后的DNA提取方法对除牛肉以外的鸡肉、鱼肉、马肉和驴肉进行DNA提取，以验证该方法在不同肉类检测中的适用性。研究表明不同肉制品均提取到较高的核酸浓度，DNA浓度在560.2～2 297.92 ng/?L，A260/A280和A260/A230分别达到1.9和1.7以上，可满足下游PCR实验的需求，结果见表4。

2.3 与商业试剂盒性能的比较

使用试剂盒与本方法（CTAB法）同时对3种肉类进行DNA提取，从核酸提取浓度及纯度、提取时间、单次核酸提取成本3方面进行对比，结果见表5。

结果显示本研究建立的方法在核酸提取纯度上与市售试剂盒并无较大差别，且有着提取浓度高、提取所需时间短、单次提取成本低的优点。

3 结论

本研究建立了一种简单、快速磁珠法肉类 DNA提取方法，该方法的核酸提取快速、质量高，同时避免了传统核酸提取中有毒有机试剂的使用。本方法采用常规的CTAB作为裂解液，只使用70%的乙醇作为漂洗液，一定程度上减少了核酸提取试剂的溶液配制难度，且具有提取过程耗时短、成本低廉、检测结果可靠的优点。本研究建立的磁珠法肉类DNA提取技术可作为基层实验室自建肉类DNA提取方案，用于肉类DNA的快速提取，为肉类食品安全检测提供技术保障。

参考文献

[1]刘达玉，肖龙泉，杜茜，等.假羊肉泛滥危害及其防治对策[J].食品安全质量检测学报，2018，9（3）：677-680.

[2]BANSAL S，SINGH A，MANGAL M，et al.Food adulteration： sources， health risks， and detection methods[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2017，57（6）：1174-1189.

[3]李文静，李燕俊.分子学方法鉴定肉制品种属来源的研究进展[J].国外医学（卫生学分册），2009，36（3）：151-158.

[4]陈笑芸，汪小福，周育，等.转基因大豆深加工食品DNA鉴定技术研究[J].中国食品学报，2013，13（4）：156-162.

[5]余巨全，巩建华，柯尊伟.对中国黄牛毛囊DNA六种提取方法的研究[J].基因组学与应用生物学，2020，39（4）：1540-1548.

基金项目：大学生科技创新基金资助项目（S202111439037）。

作者简介：肖兴玉（2000—），男，安徽蚌埠人，本科在读。研究方向：分子生物学。

通信作者：尹锐（1981—），男，吉林长春人，博士，副教授。研究方向：分子检测新方法的研究。E-mail：542977965@qq.com。6FDA8BEF-9993-46BB-B3EF-B00D1A7FA1E9