环状RNA circSATB2通过调控miR-382-5p对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究

刘博 胡金霞 胡阳

肺癌是全球范围常见的恶性肿瘤，也是死亡率较高的癌症，每年新增病例约有180万，死亡人数高达160万例[1]。虽然肺癌的治疗方法在医学上已经取得了明显效果，但是仍有一些不足出现(5年预后较差、复发性较高等)，仍需要进一步改善[2]。肿瘤恶性增殖、高度侵袭和转移，是恶性肿瘤的生物特征，也是肿瘤复发的诱因，对肺癌增殖和转移的研究具有重要意义。环状RNA(circRNA)是一种共价闭合结构的环状RNA，能够参与肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学过程[3]，如circSATB2在非小细胞肺癌组织和细胞内高表达，与肺癌敏感性、转移等有关，抑制circSATB2能够降低非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。利用在线生物信息学网站预测显示miR-382-5p是circSATB2靶基因，研究结果显示miR-382-5p在非小细胞肺癌患者血清内低表达[5]，过表达miR-382-5p能有效抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞的凋亡[6]。但是关于circSATB2与miR-382-5p二者的研究尚无明确报道，本研究通过探讨circSATB2通过靶向miR-382-5p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，为肺癌的研究提供新的作用靶点。

资料与方法

一、样本收集

收集25例在本院确诊为肺癌患者的癌旁组织和肺癌组织，放置在液氮罐内冷冻保存。所有患者在手术前均未进行任何放疗或化疗，所有患者均签署了手术知情同意书，该研究已经获得本院伦理委员会的批准(批号：HX2020025)。

二、细胞和主要试剂

永生化的支气管上皮细胞BEAS-2B、肺癌细胞H460、H1299、A549购自美国ATCC公司；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000试剂盒、Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；si-NC、si-circSATB2、miR-NC、miR-382-5p、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p由赛默飞世尔公司设计合成；引物购自上海吉玛公司；Prime Script RT Master Mix试剂盒、荧光定量试剂盒、双荧光素酶试剂盒购自美国Promega公司；MTT试剂盒购自北京索莱宝公司；Transwell购自美国Corning公司；Matrigel胶购自美国BD公司；Ki67抗体、MMP9抗体、GAPDH公司购自美国Santa Cruz公司。

三、细胞培养和分组

从液氮罐内取出永生化的支气管上皮细胞BEAS-2B、以及肺癌细胞H460、H1299、H1975，复苏后在含有10%胎牛血清、100 mg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI 1640培养基中培养，并放置在37 ℃、5% CO2培养箱中。当细胞汇合率为85%时，取H1299细胞，然后以2×105个接种至6孔板中，利用LipofectamineTM2000将si-NC、si-circSATB2、miR-NC、miR-382-5p转染至细胞内，记为si-NC组、si-circSATB2组、miR-NC组、miR-382-5p组；将si-circSATB2和anti-miR-NC、si-circSATB2和anti-miR-382-5p共转染至细胞内，记为si-circSATB2+anti-miR-NC组和si-circSATB2+anti-miR-382-5p组。

四、qRT-PCR检测circSATB2和miR-382-5p的表达

利用Trizol试剂从肺癌组织、癌旁组织、BEAS-2B细胞、肺癌细胞(H460、H1299、H1975)以及各组H1299细胞中提取总RNA，然后在紫外分光度计下检测RNA的浓度和纯度。然后利用Prime Script RT Master Mix试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照荧光定量试剂盒进行PCR反应，分别GAPDH和U6作为内参，用2-ΔΔCt法检测circSATB2和miR-382-5p的表达量。

五、MTT实验检测细胞增殖

将各组H1299细胞固定培养48 h、72 h后，按照MTT试剂盒加入新配制的MTT试剂10 μL，然后继续反应4h，除去上清液，加入150 μL的二甲基亚砜试剂，使结晶充分溶解，酶标仪490 nm检测吸光度值。

六、Transwell检测细胞迁移和侵袭

迁移实验：收集组的H1299细胞采用无血清的RPMI 1640培养基调整浓度，制成2×105个/mL的细胞悬液，在Transwell下室加入500 μL含有血清的RPMI 1640培养基，上内加入100 μL的细胞悬液，培养24 h，取去小室擦掉未迁移的细胞，采用多聚甲醛、结晶紫固定并进行染色，选择明亮视野于显微镜下观察细胞迁移数目。

侵袭实验：将Matrigel胶按照比例稀释，并铺在Transwell上室内，培养箱培养5 h，后续实验步骤同迁移实验。

七、Western Blot检测Ki67、MMP9蛋白表达

利用RIPA试剂裂解各组H1299细胞内蛋白，按照BCA法检测定量蛋白浓度，并配置8%分离胶和12%浓缩胶，取上样蛋白样品然后80V跑浓缩胶、120V跑分离胶，电泳结束后转膜，脱脂奶粉封闭培养60 min，然后加入稀释1:500的Ki67、MMP9抗体，4℃过夜孵育，加入稀释的二抗于室温下孵育60 min，滴加ECL发光液显影、拍照。以GAPDH作为内参，利用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

八、双荧光素酶报告实验

通过在线软件预测显示circSATB2和miR-382-5p存在互补核苷酸序列，然后构建miR-382-5p结合微雕的circSATB2野生型载体(circSATB2 wt)和突变型载体(circSATB2 mut)，按照脂质体法与miR-NC或miR-382-5p转染至H1299细胞内，细胞转染48 h后，利用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性。

九、统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件分析实验数据，实验结果以平均数?标准差表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、circSATB2和miR-382-5p在肺癌组织中的表达

与癌旁组织相比，肺癌组织能显著增加circSATB2表达量(P<0.05)，显著降低miR-382-5p表达量(P<0.05)(见表1)。

表1 circSATB2和miR-382-5p在肺癌组织中的表达

二、circSATB2和miR-382-5p在肺癌细胞中的表达

与永生化的支气管上皮细胞BEAS-2B相比，肺癌细胞H460、H1299、A549内circSATB2表达量显著增加(P<0.05)，miR-382-5p表达量显著降低(P<0.05)。本研究选择差异较大的肺癌细胞H1299进行后续实验(见表2)。

表2 circSATB2和miR-382-5p在肺癌细胞中的表达

三、敲低circSATB2对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与si-NC组相比，si-circSATB2组的circSATB2表达量显著降低(P<0.05)，细胞48 h、72 h的OD值显著降低(P<0.05)，细胞迁移数目、侵袭数目显著降低(P<0.05)，Ki67、MMP9蛋白表达显著降低(P<0.05)(见图1，表3)。

图1 敲低circSATB2对肺癌细胞Ki67、MMP9蛋白表达的影响

表3 敲低circSATB2对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

四、circSATB2调控miR-382-5p的表达

在线数据库预测显示circSATB2和miR-382-5p存在互补的核苷酸序列(见图2)。通过双荧光素酶报告实验进一步验证两者间的关系，结果显示，与miR-NC组相比，miR-382-5p组内circSATB2 wt荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，circSATB2 mut荧光素酶活性没有任何变化(见表4)。

图2 circSATB2和miR-382-5p互补核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

五、过表达miR-382-5p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与miR-NC组相比，miR-382-5p组的miR-382-5p表达量显著增加(P<0.05)，细胞48 h、72 h的OD值显著降低(P<0.05)，细胞迁移数目、侵袭数目显著降低(P<0.05)，Ki67、MMP9蛋白表达显著降低(P<0.05)(见图3、表5)。

表5 过表达miR-382-5p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图3 过表达miR-382-5p对肺癌细胞Ki67、MMP-9蛋白表达的影响

六、抑制miR-382-5p部分回复敲低circSATB2对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与si-circSATB2+anti-miR-NC组相比，si-circSATB2+anti-miR-382-5p组的miR-382-5p表达量显著降低(P<0.05)，细胞48 h、72 h的OD值显著增加(P<0.05)，细胞迁移数目、侵袭数目显著增加(P<0.05)，Ki67、MMP9蛋白表达显著增加(P<0.05)(见图4、表6)。

表6 抑制miR-382-5p部分回复敲低circSATB2对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图4 抑制miR-382-5p部分回复敲低circSATB2对肺癌细胞Ki67、MMP-9蛋白表达的影响

讨 论

circRNA既没有5′帽子也没有3′聚腺苷酸尾巴，具有高度的稳定性，在肺癌中异常表达[7]，有研究结果通过GEO数据研究差异表达circRNA，发现circ_102231在肺癌组织内表达上调，与晚期TNM分期、淋巴结转移和总体生存率有关，抑制circ_102231能有效抑制肺癌细胞的增殖和侵袭[8]。Chen等[9]研究结果显示，circ_100395在肺癌组织内表达下调，与肺癌患者TNM分期和转移负相关，患者预后也较差，过表达circ_100395能显著抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期，这与本研究结果相反。Han等[10]研究结果显示，在肺癌组织中circ_BANP表达上调，沉默circ_BANP能抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，通过海绵miR-503发挥在肺癌中的作用。Zhou等[11]研究结果显示，circ_102179在非小细胞肺癌组织和细胞内表达上调，circ_102179通过调控miR-330-5p/HMGB3轴促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。以上实验均说明circRNA与肺癌密切相关，可以作为肺癌的潜在标记物，本研究采用qRT-PCR检测肺癌组织和细胞内circSATB2表达变化，结果显示，circSATB2在肺癌组织和肺癌细胞H460、H1299、A549内表达量增加，说明circSATB2在肺癌中起到促癌的作用，将si-circSATB2转染至H1299内，结果显示，敲低circSATB2能够抑制细胞OD值，降低细胞迁移数目、细胞侵袭数目，下调Ki67、MMP9蛋白表达，这说明敲低circSATB2能抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-382-5p已被证明在多种癌症内低表达，如乳腺癌、血管瘤、骨肉瘤等，过表达miR-382-5p能有效抑制癌症细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡[12-14]。在胶质瘤的研究中，过表达miR-382-5p通过靶向调控PTEN抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[15]。有研究结果显示，miR-382-5p在乳腺癌组织和细胞表达下调，SNHG1通过靶向负调控miR-382-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[16]。本研究结果显示，miR-382-5p在肺癌组织和肺癌细胞H460、H1299、A549内表达量降低，过表达miR-382-5p能够降低细胞OD值，减少细胞迁移数目、细胞侵袭数目，Ki67、MMP9蛋白表达下调，这说明过表达miR-382-5p能抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。circSATB2可以充当下游miRNA海绵，在线生物信息学网站预测显示miR-382-5p是circSATB2靶基因，本研究通过双荧光素素酶实验进一步验证circSATB2和miR-382-5p二者之间的关系，发现circSATB2能调控miR-382-5p的表达，抑制miR-382-5p部分回复敲低circSATB2对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，说明circSATB2可能通过调控miR-382-5p的表达发挥在肺癌中的作用。

综上所述，circSATB2在肺癌组织和细胞内表达上调，miR-382-5p表达下调，敲低circSATB2可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与过表达miR-382-5p有关。