山豆根药材UPLC-UV指纹图谱及3种成分含量测定研究

南俊伶，王超众，闫广利*，吴芳芳，宋志军，王硕，周小雷，缪剑华，王喜军，*（.黑龙江中医药大学，国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心，教育部经典名方有效性评价及产业化开发工程研究中心，哈尔滨 50040；.广西壮族自治区药用植物园，西南濒危药材资源开发国家工程实验室，南宁 53003）

山豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根茎，又名广豆根，主要分布于广西、贵州等地[1]，具有清热解毒、消肿利咽的功效[2]。现代药理学研究表明，山豆根具有抗肿瘤[3]、抗病毒[4]、镇痛、抗炎[5]、抗肝损伤[6]、抗氧化[7]以及增强免疫[8]等药理作用。山豆根中主要含有生物碱类、黄酮类、三萜类成分[9]，《中国药典》规定山豆根中含苦参碱和氧化苦参碱的总量不得少于0.70%[2]，除药典规定外，也有研究对山豆根中的金雀花碱、槐果碱、槐醇、芒柄花素、越南槐醇以及高丽槐素等成分的含量进行检测[10-12]，然而仍没有对山豆根各类成分进行整体分析的质量控制方法。本课题利用超高效液相色谱-紫外光谱法对山豆根药材进行指纹图谱分析，并同时测定三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素等3个非生物碱活性成分的含量，为山豆根药材的整体质量控制提供有效方法。

1 材料

超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC，美国Waters公司）；光电二极管阵列检测器（ACQUITY PDA，美国Waters公司）；电子分析天平（AE-240，瑞士梅特勒公司）；数控超声波清洗器（KQ-300DA 型，中国昆山市超声仪器有限公司）；国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012年版。

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；磷酸（色谱纯，中国科密欧化学试剂公司公司）；甲醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；水为超纯水。

高丽槐素（批号：RFS-M03002005008）、氧化苦参碱（批号：Y-013-181216）、三叶豆紫檀苷（批号：RFS-S06111812027）（对照品，纯度均＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；山豆根素对照品（批号：21S059-A2，纯度＞95.8%，上海甄准生物科技有限公司）。16批山豆根药材产地如表1所示，经鉴定为豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根茎。

表1 山豆根药材产地 Tab 1 Origin of 15 batches of Sophora Tonkinensis

2 指纹图谱分析方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如表2；检测波长203 nm；流速0.3 mL·min-1；柱温25℃，进样量1 μL。

表2 梯度洗脱程序 Tab 2 Elution gradient

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素、氧化苦参碱的对照品适量，精密称定，配制成质量浓度分别为0.9810、0.9810、0.9580、0.9820 mg·mL-1的对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取山豆根药材细粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，再称定重量，用80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取山豆根药材细粉0.5 g，精密称定，制备供试品溶液，连续进样6针，采集色谱图。以7号峰高丽槐素为参照峰，计算10个色谱峰的相对峰面积RSD在0.720%～3.4%，相对保留时间RSD在0.010%～0.11%，表明仪器的精密度较好。

2.3.2 稳定性试验 取山豆根药材细粉，制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、18、24 h注入液相色谱仪进行分析，以7号峰高丽槐素为参照峰，计算10个色谱峰的相对峰面积RSD为0.80%～4.2%，相对保留时间RSD为0.010%～0.42%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一批山豆根药材细粉，称取0.5 g，精密称定，共6份，平行制备供试品溶液，进样测定。以7号峰高丽槐素为参照峰，计算10个色谱峰的相对峰面积RSD为0.89%～4.0%，相对保留时间RSD为0.010%～0.19%。表明供试品溶液制备方法的重复性较好。

2.4 山豆根指纹图谱的建立

2.4.1 指纹图谱采集与相似度评价 取16批山豆根药材样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下条件建立指纹图谱并进行比较，共确定10个共有峰。山豆根指纹图谱中峰7被鉴定为高丽槐素，是山豆根的主要活性成分，在该指纹图谱中峰面积适中，峰位居中，分离度良好，保留时间和峰面积稳定，因此选择峰7作为参照峰。对10个共有峰进行统一积分后，将所得图谱以cdf格式导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件进行处理，生成对照指纹图谱。运用多点校正方法对16批样品的共有峰进行匹配，得到指纹图谱的叠加图，计算16批山豆根的指纹图谱与对照指纹图谱的相似性，结果见图1和表3。各批次相似度结果在0.926～0.989，表明以该指纹图谱能够有效表征山豆根药材的整体化学特征，暂定样品指纹图谱与对照指纹图谱比较，相似度不小于0.9，用于山豆根药材的整体质量控制。

图1 16批山豆根药材的UPLC指纹图谱和对照指纹图谱（R）Fig 1 UPLC fingerprint and control fingerprint（R）of 16 batches of Sophora Tonkinensis

表3 16批山豆根药材UPLC指纹图谱相似度评价结果 Tab 3 UPLC fingerprint similarity evaluation of 16 batches of Sophora Tonkinensis

2.4.2 共有峰相对保留时间和相对峰面积 计算16批山豆根指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果共有峰的相对保留时间的RSD值在0.01%～1.4%，相对峰面积的RSD值较大，说明各批次间成分含量存在较大差异。

2.4.3 指纹图谱共有峰指认 取氧化苦参碱、三叶豆紫檀苷、山豆根素、高丽槐素对照品溶液以及山豆根药材供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，采集色谱图如图2所示。通过比较保留时间和紫外光谱图，鉴定峰2为氧化苦参碱，峰5为三叶豆紫檀苷，峰7为高丽槐素，峰9为山豆根素。

图2 山豆根UPLC-UV指纹图谱Fig 2 UPLC-UV characteristic spectrum of Sophora Tonkinensis

3 含量测定分析方法与结果

3.1 对照品溶液的制备

分别取三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素对照品适量，精密称定，配制成三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素的质量浓度分别为9.810、14.71、47.90 μg·mL-1的混合对照品溶液，摇匀，备用。

3.2 方法学考察

3.2.1 系统适用性考察 取对照品溶液及供试品溶液进样检测，记录色谱图（见图3）。各化合物峰均能达到良好的分离，分离度均＞1.5，理论塔板数均不低于100 000。

图3 山豆根UPLC-UV色谱图Fig 3 UPLC-UV chromatogram of Sophora Tonkinensis

3.2.2 线性关系考察 取对照品储备液适量，配制成含三叶豆紫檀苷49.05 μg·mL-1、高丽槐素73.57 μg·mL-1、山豆根素239.5 μg·mL-1的混合对照品溶液，用甲醇稀释，得到系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件测定色谱图，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归分析，得回归方程、相关系数及线性范围，见表4。

表4 线性关系考察结果 Tab 4 Linear relationship

3.2.3 精密度试验 取“3.1”项下对照品溶液，连续进样6次，计算三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素峰面积的RSD值分别为0.84%、0.52%、0.39%，表明仪器精密度良好。

3.2.4 重复性试验 取同一批山豆根药材样品，称取0.5 g，精密称定，共6份，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样测定。随行测定对照品溶液计算含量，测得三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素含量的RSD值分别为2.5%、1.4%、1.9%，表明该方法重复性良好。

3.2.5 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、18、24 h进样测定，计算三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素峰面积的RSD值分别为4.1%、1.5%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.2.6 加样回收试验 称取山豆根样品共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别按已知成分含量的100%加入三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素的对照品，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样测定，计算三叶豆紫檀苷、高丽槐素、山豆根素的平均回收率分别为95.31%、96.14%、98.94%，RSD值分别为4.4%、1.4%、1.8%，表明该方法准确度良好。

3.3 山豆根药材含量测定

取16批山豆根药材样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分含量，结果见表5。

表5 16批山豆根药材的含量(%) Tab 5 Content of 16 batches of Sophora Tonkinensis (%)

4 讨论

4.1 提取条件的优化

本研究在供试品溶液的制备方面提取溶剂考察了水、甲醇（25%、50%、80%、100%）以及乙醇（25%、50%、80%、100%），提取方式考察了超声提取（30、60、90 min），回流提取（30、60、90 min）。研究发现利用加热回流方法提取山豆根药材时，峰6随着加热时间延长，其峰面积逐渐减小，而峰5随着加热时间延长，峰面积逐渐增加，两者总峰面积基本不变，表明峰6加热提取过程不稳定，因此，为真实表征山豆根药材化学成分，采用超声提取的方法。比较发现，使用80%乙醇超声提取30 min能够获得更全面的色谱峰和更高的峰强度，因此，选择80%乙醇超声提取30 min。

4.2 色谱条件的优化

采用PDA检测器在200～400 nm波长内进行扫描，提取不同波长下的色谱图，发现在203 nm波长下色谱峰较多，峰强度均匀适中，且待测物均具有最大吸收。对色谱柱Acquity UPLC BEH C18柱和Waters Acquity UPLC HSS T3柱，流动相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水（0.05%、0.1%、0.2%），柱温23、25、27℃，流速0.24、0.3、0.36 mL·min-1进行考察，最终选择本文的色谱条件。

4.3 用于山豆根药材整体质量控制的分析

山豆根含有生物碱、黄酮、三萜、有机酸等多种活性次生代谢产物，然而目前《中国药典》仅对其所含有的苦参碱和氧化苦参碱进行控制，存在专属性差和药效关联性差的不足。苦参碱和氧化苦参碱具有抗炎镇痛[13]、抑菌[14]、抗肿瘤[15-16]等广泛的药理作用，因此传统认为苦参碱和氧化苦参碱为山豆根的主要有效成分，并规定其在山豆根中含量总和不低于0.70%。近年来，山豆根非生物碱类成分受到关注，研究发现山豆根氯仿部位具有显著的抗鼻咽癌作用，成分分析表明该部位主要含有三叶豆紫檀苷、高丽槐素、染料木素等非生物碱类成分[17]。因此，有必要对山豆根生物碱、黄酮等成分进行全面分析，建立整体化学成分表征方法，有效控制山豆根药材质量。本研究利用超高效液相色谱法，通过优化提取方法和色谱条件，建立了涵盖氧化苦参碱、高丽槐素、三叶豆紫檀苷、山豆根素等10个共有成分峰的指纹图谱测定方法，测定了来自广西、广东、贵州三大产地的16批山豆根药材，表明各产地山豆根相似度较高，有效表征了山豆根药材的整体物质基础，可以整体化学组成上控制山豆根药材的质量。

《中国药典》规定了山豆根药材中苦参碱和氧化苦参碱的含量，为进一步控制黄酮类成分的含量，本研究在指纹图谱测定基础上，选择含量较高的高丽槐素、三叶豆紫檀苷、山豆根素作为质控成分建立含量测定方法。苏雯清等[18]研究发现高丽槐素可显著抑制鼻咽癌细胞CNE-1的增殖、克隆与迁移，并且可促进细胞凋亡。Zhang等[19]研究发现三叶豆紫檀苷可以通过抑制m-TOR/PI3K/AKT信号通路，诱导胃癌细胞自噬和线粒体介导的凋亡。Kajimoto等[20]发现山豆根素可以诱导人白血病U937细胞凋亡。高丽槐素、三叶豆紫檀苷、山豆根素都有明确的抗肿瘤活性，可能是山豆根抗肿瘤作用的主要有效成分。因此，本研究同时测定指纹图谱和高丽槐素、三叶豆紫檀苷、山豆根素的含量，与《中国药典》含量测定项相结合，为山豆根药材的整体质量提供了有效的评价方法。黄乐等[11]对7个产地的山豆根成分含量进行测定，发现高丽槐素含量在0.05%～0.11%，何常明等[21]对17个批次的山豆根中的黄酮类成分进行含量测定，发现三叶豆紫檀苷的含量在0.05%～0.20%，含量波动范围与本研究结果基本一致，本研究首次测定了山豆根药材中山豆根素的含量，以往文献未见报道。16批山豆根中3种成分的含量有较大差异，可能与不同产地以及采收日期等因素有关。

本试验利用UPLC-UV法建立了山豆根药材的指纹图谱，并测定了高丽槐素、山豆根素以及三叶豆紫檀苷的含量，为山豆根整体质量评价提供了新方法，为山豆根的质量控制提供了参考。