扣囊复膜酵母生物学性状及生理生化特性研究

王志男， 杨 佳， 李新生，2，3*， 耿敬章，3， 吴东平

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 中国谢村北派黄酒研究院， 陕西 汉中 723000；3.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验， 陕西 汉中 723000；4.陕西省秦洋长生酒业有限公司， 陕西 汉中 723000)

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)，又名扣囊复膜孢酵母、扣囊拟内孢霉(Endomycopsisfibuligera)[1]，是一类产子囊孢子的二形态酵母[2]，可产生假菌丝和子囊孢子，子囊内可产生2～4个孢子[3]。广泛存在于高淀粉含量基质中，能够分泌淀粉酶、酸性蛋白酶及β-葡萄糖苷酶[4-6]等在发酵过程中不可或缺的重要酶系，对发酵食品中营养物质以及风味物质的形成具有关键作用。大量研究发现扣囊复膜酵母广泛存在于国内外各种发酵剂、大曲或酒醅中，如黄酒、白酒和食醋等[7-13]。扣囊复膜酵母具有优异的产酶能力及产香产酯能力，在酿造产业中具有很高的应用价值[14-19]。

中国黄酒分为南派和北派黄酒，其中谢村黄酒属于北派黄酒的一个分支，其产地在陕西省汉中市洋县。谢村黄酒是以糯米为主要原料，采用自产独有的麦曲(或药曲)为发酵剂，固液二次连续发酵和陈酿而酿制成。前期的研究中已从谢村黄酒高温型麦曲中分离纯化得到可用于纯菌种发酵制剂研发的扣囊复膜酵母M33、黑曲霉M9和枯草芽孢杆菌N5[20]，其中M33的生物学性状及其生理生化特性尚缺乏系统性研究，还有待进一步完善。本实验以谢村黄酒麦曲中分离得到的扣囊复膜酵母M33为研究对象，以酿酒酵母为参照，系统研究M33的生物学性状和生理生化特性，旨在为扣囊复膜酵母的菌种鉴定提供理论依据和扣囊复膜酵母M33在黄酒产业中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

扣囊复膜酵母M33：陕西省食药用菌工程技术研究中心；酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司。蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、氯化钠、柠檬酸、乙酸钠、氯化钾、无水乙醇、溴甲酚紫、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、牛肉粉、硝酸铵、尿素、孔雀绿、番红、95%乙醇(以上试剂均为分析纯)：天津市盛奥化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ZWT-2112B震荡培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；BX53F生物显微镜：奥林巴斯(中国)有限公司；ZHJH-C111213超净工作台：苏州净化仪器公司；SPX-250BSH-11生化培养箱：上海新苗仪器公司；ZXRD-7230鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；DT5-1低速台式离心机：湘仪离心机仪器有限公司；UV2550紫外分光光计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备

本实验所用培养基：YPD培养基、麦氏产孢培养基、液体发酵培养基、糖发酵培养基、碳源同化培养基、氮源同化培养基具体制备方法参照《食品微生物学实验原理与技术》[21]。

1.3.2 酵母菌落形态观察

将低温保藏的酵母菌取出后在无菌条件下转接至YPD液体培养基，于28 ℃、160 r/min振荡活化12 h，活化后转接到YPD固体培养基28 ℃培养2 d，观察其菌落形态。

1.3.3 酵母细胞形态观察

无菌状态下挑取一环酵母菌接种到YPD液体培养基中，于28 ℃、160 r/min振荡培养，分别在0、12、24、36、48 h时取样，在无菌水中进行适当稀释制成菌悬液，移取菌悬液于载玻片上，盖上盖玻片压制均匀无气泡，在显微镜下观察其细胞形态并拍照。

1.3.4 酵母菌丝形态观察

当1.3.3所制酵母培养基振荡培养至24 h时取样，在无菌水中进行适当稀释制成菌悬液，移取菌悬液于载玻片上，盖上盖玻片压制均匀无气泡，在显微镜下观察其菌丝形态并拍照。

1.3.5 酵母子囊孢子形态观察

菌株的子囊孢子观察方法见文献[22]。

1.3.6 酵母生长曲线的测定

酵母生长曲线的测定采用比浊法，具体方法参照文献[23]。

1.3.7 酵母实验

酵母糖发酵、碳源同化、氮源同化实验具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[24]及《微生物学试验教程》[25]。

1.3.8 扣囊复膜酵母M33耐受性实验

乙醇耐受性：向已灭菌的液体发酵培养基中添加已使用0.22 μm滤膜过滤的无水乙醇，使乙醇终浓度分别为体积分数2%、4%、6%、8%、10%、12%，分别接种1 mL M33菌悬液。

渗透压耐受性：按体积分数2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%的葡萄糖含量分别配制液体发酵培养基，分别接种1 mL M33菌悬液。

分别调节液体培养基pH至6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2，分别接种1 mL M33菌悬液。

将已接种的培养基于28 ℃、160 r/min振荡培养24 h，取5 mL菌悬液至10 mL离心管中，在6000 rpm条件下离心10 min，倒去上清液，蒸馏水洗涤3次，除去杂质，将处理后的菌悬液采用紫外分光光度计在600 nm处测吸光值。

夏日哈木矿区总共圈出铜镍矿体20条[3]，其中HS26号异常区圈出8条铜镍钴矿体，含矿岩性主要为橄榄岩和辉石岩，其次为辉长岩，通过对8条矿体进行资源量估算，求得333+334镍金属量105.06万吨，其中(333镍金属量84.62万吨，334镍金属量20.44万吨)，镍平均品位为0.64%；8条矿体中伴生铜金属量20.86万吨，铜平均品位0.169%；伴生钴金属量4.22万吨，钴平均品位为0.026%。

1.3.9 数据处理与分析

采用IBM SPSS Statistics 26对数据进行处理分析，绘图由Origin 2019b 64 bit完成。

2 结果与分析

2.1 酵母菌落形态特征

如图1①—③所示，M33在YPD固体培养基上生长较快，2 d后成熟，平板上有淡淡的酒酿香味，单菌落呈规则的圆形，白色，干燥不透明，表面及边缘覆盖有细小绒毛，菌落与培养基结合紧密不易挑取，菌落直径3～5 mm。

如图1④—⑥所示，酿酒酵母在YPD固体培养基上生长迅速，2 d后成熟，平板上有较浓的酒酿气味，单菌落呈圆形或椭圆形，乳酪色，湿润光滑，不透明，菌落与培养基结合不紧密极易挑取，菌落直径2～4 mm。

①—③M33在YPD固体培养基上28 ℃培养2 d的菌落形态；④—⑥酿酒酵母在YPD固体培养基上28 ℃培养2 d的菌落形态

2.2 酵母细胞形态特征

M33和酿酒酵母细胞形态特征见图2。

a—e分别为M33培养0、12、24、36、48 h的细胞形态；f—j分别为酿酒酵母培养0、12、24、36、48 h的细胞形态

如图2a—e所示，M33在显微镜下观察多呈卵形、无色透明单细胞。其在YPD液体培养基中振荡培养12 h时，细胞大多呈菌丝状；24 h时，菌丝体延伸，体积变大，但数量有所减少，单细胞数量骤增；36～48 h时，菌丝体数量递减，单细胞逐渐占据主体。

如图2f—j所示，酿酒酵母在显微镜下观察多呈球形或椭圆形、无色透明单细胞。其在YPD液体培养基中振荡培养12 h时，细胞大多数处于出芽状态，单细胞数量较少；24 h时，单细胞数量增加，出芽率降低芽体减少，二者数量接近；36～48 h时，芽体数量递减，视野中单细胞逐渐占据主体。

2.3 酵母菌丝形态特征

如图3A、B所示，M33在营养丰富的YPD液体培养基中为多极出芽繁殖，但长大的子细胞与母细胞不分离并继续出芽，连接成长链，并有分枝，最终形成树枝状菌丝体；细胞之间的连接处缢缩没有横隔，菌丝为藕节状，呈明显的假菌丝特征。

如图3C、D所示，酿酒酵母在营养充足的YPD液体培养基中为典型多位出芽繁殖，繁殖旺盛时会形成芽簇，但出芽产生的子细胞长大后会脱落与母细胞分离，不产生菌丝体。

A、B为M33的假菌丝形态,C、D为酿酒酵母的芽体形态

2.4 酵母子囊孢子形态特征

M33和酿酒酵母子囊孢子形态特征见图4。

如图4A所示，细胞经孔雀绿溶液和番红溶液染色后，子囊呈红色，子囊孢子呈绿色。表明M33在营养匮乏的麦氏培养基中可进行有性生殖，酵母细胞通过结合形成子囊，子囊内经过质配、核配与减数分裂产生子囊孢子，形状呈椭圆形。

如图4B所示，酿酒酵母在营养匮乏的麦氏培养基中可进行有性生殖，通过细胞结合进行有性生殖，产生子囊孢子，形状呈圆形或椭圆形。

A、B分别为M33和酿酒酵母的子囊孢子形态

2.5 酵母生长曲线绘制

M33和酿酒酵母的生长曲线对比如图5所示，M33和酿酒酵母在0～4 h阶段属于迟缓期，此阶段酵母菌需要适应新的环境，并且为后期的生长储备足够的物质基础，生长速率缓慢。M33和酿酒酵母在4 h时均进入对数期，M33对数期阶段为4～32 h，酿酒酵母对数期为4～20 h；此阶段酵母菌经过前期的准备已适应环境，生长速率达到最快、代谢旺盛、酶系活跃、活细胞数和总细胞数大致接近。M33在32～48 h及酿酒酵母在20～56 h属于稳定期，此阶段细胞数达到最高峰并保持相对稳定、细胞代谢产物积累达到最高峰。M33在32 h及酿酒酵母在20 h时进入了衰亡期，此阶段由于培养基中的营养逐渐耗尽，细胞衰亡速度大于繁殖速度，总数负增长，细胞逐渐死亡出现自溶现象。

图5 扣囊复膜酵母M33和酿酒酵母生长曲线对比图

2.6 酵母糖发酵实验

采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维二糖6种糖分别作为培养基中唯一碳源进行糖发酵实验，实验结果见表1,可知，M33和酿酒酵母对以上各种碳源的利用情况有所不同。酿酒酵母整体发酵速度快于M33，但M33可以分解利用除了乳糖的其他5种碳源进行发酵，产酸产气；而酿酒酵母只能分解利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖3种糖，无法分解乳糖、淀粉及纤维二糖来进行发酵。

2.7 酵母碳源同化实验

采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维二糖6种糖分别作为培养基中唯一碳源进行酵母碳源同化实验，实验结果见表2。可知，M33可以同化以上全部6种碳源获取能量以保证自身生长繁殖；而酿酒酵母只能同化葡萄糖、蔗糖和麦芽糖3种糖，无法同化乳糖、淀粉及纤维二糖供自身利用。

表2 扣囊复膜酵母M33和酿酒酵母碳源同化实验结果对比

2.8 酵母氮源同化实验

采用蛋白胨、牛肉粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素5种含氮化合物分别作为培养基中唯一氮源进行氮源同化实验，实验结果见表3。可知，M33和酿酒酵母均可以利用以上全部5种含氮化合物来维持正常生长与代谢。

表3 扣囊复膜酵母M33和酿酒酵母氮源同化实验对比

2.9 扣囊复膜酵母M33耐受性实验

酵母菌的耐受性测定对于黄酒的实际生产实践有着重要的指导意义。当酵母菌处在适宜的环境中时，繁殖能力高、发酵速度快，在快速产生酒精、功能因子以及香气物质的同时也可降低杂菌污染影响酒体品质的风险；反之当酵母菌处于恶劣的环境时，其生长繁殖受到抑制，可能会导致酿造工期延长、被有害菌污染变质等风险。

2.9.1 乙醇耐受性

M33在体积分数0～12%的乙醇含量的培养基中的生长情况如图6所示，随着培养基中乙醇含量的升高，M33的生长速率在逐渐下降，乙醇浓度的升高会对M33起抑制作用。在体积分数0～4%乙醇时生长速率缓慢下降，体积分数高于4%乙醇时急速下降直至8%时趋于零。表明M33在体积分数低于4%乙醇时可保持较稳定的生长速率，在体积分数4%～8%乙醇含量下虽然受到抑制但还能生长，体积分数大于等于8%乙醇时就会完全受到抑制，无法生长。

图6 扣囊复膜酵母M33乙醇耐受能力测定

2.9.2 渗透压耐受性

M33在体积分数0～60%的葡萄糖含量的培养基中的生长情况如图7所示，随着培养基中葡萄糖含量的升高，M33的生长速率在逐渐下降，葡萄糖浓度的升高会对M33起抑制作用。M33在低于体积分数30%葡萄糖时生长速率缓慢下降，在体积分数30%～40%葡萄糖时急剧下降，在大于体积分数40%葡萄糖时生长速率逐渐趋于零，直至含量高达60%时无法生长。

图7 扣囊复膜酵母M33渗透压耐受能力测定 图8 扣囊复膜酵母M33酸耐受能力测定

2.9.3 酸耐受性

M33在pH为6～2的培养基中的生长情况如图8所示，随着培养基中pH的升高，M33的生长速率出现多次转折：M33在培养基pH为6～5时生长速率缓慢下降；pH为5～4时M33生长速率出现回升，直至pH为4时数量级达到最高峰，表明M33生长繁殖最适pH为4；随着pH的继续降低，M33的生长速率开始急剧下降，在pH小于3时生长速率逐渐趋于零，pH到2时无法生长。

3 结论

本实验通过对扣囊复膜酵母M33生物学性状及生理生化特性的研究，结果表明，M33单菌落呈规则的圆形，白色，干燥不透明，表面覆盖有细小绒毛，不易挑取。其生殖方式为出芽繁殖；相比于酿酒酵母，在生长初期M33适应新环境的速度更快；M33维持旺盛的繁殖状态以及活跃的代谢状态时间更久。M33可在无氧条件下分解利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维二糖5种糖进行发酵产生乙醇和CO2并获取能量，无法利用乳糖；在有氧条件下可同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维二糖6种碳源获取能量。氮源主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成，是酵母细胞维持正常生长与代谢的基础，若缺乏则无法正常生长。M33可利用蛋白胨、牛肉粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素5种含氮化合物来进行正常生长代谢。M33可耐受体积分数7%～8%乙醇、50%～60%葡萄糖及pH为2～3的酸性环境。本研究为扣囊复膜酵母的菌种鉴定提供了理论依据和扣囊复膜酵母M33在黄酒产业中的应用提供科学依据。