八泉峡一株丝状蓝藻的形态与分子生物学鉴定

肖 喆，王 捷，石 瑛,2，降美婷，霍 薇，王嘉姝

(1.太原师范学院 生物系，山西 晋中 030619; 2.山西工程科技职业大学，山西 晋中 030619)

蓝藻是一种形态多样的光合原核生物，他们占据了广泛的生态位，世界各地均可发现其身影.Komárek等人[1]在2014年提出基于16S rRNA基因序列分析的分类体系，描述了大量新的分类群.多相分类方法的应用，避免了仅依靠形态学分类的弊端，为系统发育重建发挥了重要的价值.在研究颤藻目的过程中，专家们反复强调其异质性[2].如最近几年独立出的新属Kamptonema[3]、Cephalothrix[4]、Ancylothrix[5]等.在颤藻目中，一些藻种可产生藻毒素，对人体和动物体的健康造成危害，某些蓝藻还可判断水体的一些特性和组成状况，分解水体中有机成分，可达到净化水体的作用.

长治八泉峡位于山西壶关太行山大峡谷，流域面积广，其内包含江河峡谷、石灰岩干旱峡谷与溪流峡谷等地带，具有巨大的研究价值.本研究对山西省长治市大峡谷八泉峡的蓝藻进行采集分离，得到一株丝状蓝藻，应用16S rRNA和cpcBA-IGS基因序列进行分类学鉴定，进一步探讨该地区蓝藻的分类地位及与其它藻种的亲缘关系，研究结果可为今后长治大峡谷地区丝状蓝藻种类的快速鉴定提供有效的方法和基础，为长治地区蓝藻资源的保护和利用提供一定的分类学依据.

1 材料与方法

1.1 藻种采集与分离

2020年9月于山西省长治市八泉峡景区使用浮游生物网采集浮游植物水样.获得的藻样于当天在实验室进行镜检，然后在体式显微镜下利用毛细管分离法挑取单个藻丝体，培养在含BG-11或CT培养基的24孔细胞培养板中.当长出形态一致的藻样后，转入锥形瓶中扩大培养，放置在恒温光照培养箱中，光照强度为2 000 Lx，温度为(25±1)℃，光暗循环周期为12 h(光)：12 h(暗).

1.2 形态学鉴定

将藻液制成临时玻片，在光学显微镜下观察其形态结构，并拍照记录.利用Nikon ECLIPSE Ci显微镜评估自然条件和培养条件下种群形态变异.对细胞的宽度、长度、顶端细胞的形状和尺寸等分类学特征进行分析.每个样本至少包含30个藻丝体.该样品现保存在太原师范学院藻种库.

1.3 分子生物学鉴定

取对数期生长旺盛的新鲜藻液，12 000 r/min 离心8 min，去除上层培养基，加入20 μL无菌水，利用CTAB法提取DNA基因组，用于扩增16S rRNA基因序列的引物为：1(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)[6]和1480(5’-AGTCCTACCTTAGGCATCCCCCTCC-3’)[7]；用于扩增cpcBA-IGS基因序列的引物为：pcβF(5’-GGCTGCTTGTTTACGCGACA-3’)和pcαR(5’-CCAGTACCACCAGCAACTAA-3’)[8].扩增产物由以稀释至100倍的4S Red Plus核酸染色剂进行染色后，电泳检测其条带亮度，产物由北京华大基因科技有限公司测序与拼接.将获得的序列与NCBI数据库上发表的序列进行比较，并选取与BLAST相似度较高的序列组成数据库.采用软件BioEdit 7.2进行序列比对和利用MEGA 7.0构建系统发育树.基于16S rRNA基因序列构建系统发育树使用的模型为HKY+G+I.基于cpcBA-IGS基因序列构建的系统发育树模型为K2.系统发育树采用自举检验(Bootstrap)计算置信区间，自展数据集为1 000.

2 结果

2.1 形态特征

光学显微镜形态观察结果详见图1.丝状体单生或紧密缠绕形成致密的膜状结构，藻丝直立或轻微弯曲，蓝绿色，宽为6～8.5 μm.具兼性鞘，附着在藻丝上，坚固，薄，无色.藻丝呈圆柱状，末端无衰减，横壁几乎不收缢，宽为5～5.6 μm，长为5.6～7.5 μm.细胞内含蓝绿色颗粒，有时为分散的、较大的颗粒.顶端细胞圆形，无帽状结构.藻丝不分枝，无异形胞，以藻殖段的方式繁殖.从藻体形态可看出，该丝状蓝藻与Potamolinea[9]的所描述的形态特征基本一致.

图1 长治市八泉峡丝状蓝藻的形态特征

2.2 系统发育分析

研究藻种的16S rRNA基因序列与GenBank数据库的序列比较，与Potamolinea[9]的相关种类相似度达到98%以上，与颤藻目其他藻种的相似度低于94%.所构建的系统发育树以粘菌藻(Gloeobacterviolaceus)为外类群，构建系统发育树用到邻接法(NJ)、最大似然法(ML)、最大简约法(MP)，三种方法具有较为一致的分支位点的拓扑结构，因此，文中只展示了以NJ方法构建的系统发育树，在图中分支节点处标出了NJ/ML/MP的自展支持率.本研究的藻株所在分支得到了较高的支持率(96/94/98)，从而聚集在一个分支上(图2).

标尺每刻度代表0.01的进化距离，节点处数字代表NJ，ML和MP方法构建的系统树的支持率，低于50%的未显示

cpcBA-IGS包含高度可变的基因间隔区(IGS)以及cpcB基因末端和cpcA基因的前端，表现出高度的变异性，因此是一种有效的分子标记.由于Potamolinea[9]藻株缺乏该基因的相关数据，本研究只选取与颤藻科相关的丝状蓝藻构建系统发育树(图3)，以色球藻(Chroococcussp.)为外类群.系统发育树表明，BQX-1与其他丝状蓝藻相似度较低，并单独为一支，表明为颤藻科藻种.

节点处数字代表NJ，ML和MP构建系统发育树的支持率，低于50%的未显示

3 讨论

Potamolinea[9]是从席藻属中分离出的，其模式种为Potamolineamagna，在Martins等人的研究中表明，Potamolinea[9]属内种之间16S rRNA序列的相似度较高(大于95.3%)，与其它属的相似度低于93.88%，证实该属为独立的群体.在形态特征和生态环境方面，Potamolinea[9]末端不衰减，钝圆或变短，细胞内含有颗粒状物质，横壁收缢或不收缢，具兼性鞘.生境为湖泊生态系统中淡水底栖生物上附着.本文通过毛细管分离法从山西省长治市八泉峡地区分离出1株丝状蓝藻，并基于显微观察和基因分析，对该藻株进行鉴定.本藻株的形态特征为具鞘，横壁不收缢，细胞内含有颗粒状物质，系统发育分析结果证明BQX-1与Potamolinea[9]聚为一支，支持率较高，相似度达98%以上，因此形态分类研究与分子系统发育分析的结果均与Potamolinea[9]相符.

分类学分类是对世界上各种生物类群进行识别鉴定与检验论证的唯一方法[10]，长期以来蓝藻的分类依赖于形态学和生态学，作为不含异形胞的、形态较为简单的颤藻目，仅依据形态学不再能完全鉴定其进化史，表型相似的藻丝体表现出相当大的遗传多样性.多相分类方法的引入极大的改变了其分类标准，为蓝藻的分类提供了新的途径.在此背景下，本文以存在分类问题的颤藻科作为研究对象，为其分类修订提供理论基础，同时对山西省藻类资源的开发利用提供科学依据.