基于LC-QTOF-MS代谢组学研究甲基苯丙胺临床戒毒分期

王敬淇，王 叶，张 艺，梁军成，邓艳萍，杭太俊*，宋 敏**

（1中国药科大学药学院，南京 210009；2国家禁毒委员会办公室中国药科大学禁毒关键技术联合实验室，北京 100193；3北京大学中国药物依赖性研究所，北京 100191）

甲基苯丙胺的滥用是全球公共卫生安全的一大隐患［1］。甲基苯丙胺作为一种中枢神经系统的兴奋剂，能增加儿茶酚胺类物质的释放，并部分阻断其再摄取［2］，从而间接产生多种中枢和外周效应，如精神运动的激活、欣快感和食欲下降等［3］。长期或过量使用将产生严重的不良反应包括情绪躁动，焦虑愤怒，精神病［4-5］，胃肠道、内分泌并发症和心血管疾病等［6］。甲基苯丙胺的高复吸率和严重滥用，不仅给成瘾者的身体及精神带来损伤，还对其家庭生活和社会安全带来严重影响［7］。

生物标志物已广泛运用于临床医学中，可通过对生物标志物的分析来对疾病进行分期，也可以作为疾病预后的指标和监测疾病对治疗的反应［8］。因此可根据甲基苯丙胺成瘾者和戒毒康复者体内相关生物标志物的变化对甲基苯丙胺成瘾及戒毒阶段进行科学判断。虽然在甲基苯丙胺成瘾的研究中生物标志物的研究日益增多，生物标志物的检测技术也越来越多样化，但用于临床辅助诊断的数目还很有限［7］。一方面，国内外甲基苯丙胺成瘾生物标志物的研究主要基于动物模型进行探索，通过研究药物成瘾的动物尿样或血样的代谢轮廓，观察成瘾引起的代谢特征［9-11］。而动物与人体的代谢物存在一定差异，动物研究中提出的甲基苯丙胺相关潜在生物标志物需要在临床实验中得到进一步验证；另一方面，进入临床实验阶段的生物标志物大多基于基因组学或蛋白组学进行探究，研究表明，甲基苯丙胺成瘾者血浆中的micro-RNA［12］、多种血清蛋白质［13］和补体因子H［14］水平与健康人相比有所变化。与其他组学相比，人类代谢组学研究将更为直接，2019年Lin等［15］首次对甲基苯丙胺成瘾者血清代谢轮廓进行了研究，但目前在甲基苯丙胺成瘾方面的人类代谢组学研究还远远不够。

代谢组学通过检测细胞［16-18］、组织［19］、器官或体液中的数千个小分子来观察整个机体的生化变化，随后采用信息学技术定义代谢组学特征［11］。代谢组学是描述由疾病或异常状况引起的代谢系统紊乱的有力工具，并已成功应用于疾病诊断［20］、生物标志物筛选［21-22］和代谢途径表征［23］等许多领域。本研究基于代谢组学，采用了高灵敏、高通量的液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（LCQTOF-MS）分析技术，分别对甲基苯丙胺成瘾者、戒毒康复者和健康人的血浆、血清和尿液进行分析，寻找代谢物与代谢途径之间的联系，旨在发现能用于甲基苯丙胺临床戒毒分期的潜在生物标志物，为甲基苯丙胺成瘾的科学判断提供依据。

1 材 料

1.1 试剂与仪器

乙腈（HPLC 级，德国默克公司）；丙酮、甲酸（AR 级，南京化学试剂有限公司）；蒸馏水（中国屈臣氏公司）；LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪（日本岛津公司）。

1.2 样品收集

采用病例对照研究的方法，进行甲基苯丙胺成瘾、戒毒康复者与健康人对照的代谢组学研究。试验组选择确诊的甲基苯丙胺成瘾者，分为两组，试验Ⅰ组（急性期组）为新入院甲基苯丙胺成瘾者，试验Ⅱ组（康复期组）为甲基苯丙胺成瘾戒毒康复者；对照组（健康组）为健康志愿者。试验组甲基苯丙胺成瘾者近6个月每周使用甲基苯丙胺不少于3次，滥用时间在2年以上（康复者指戒断前状况），试验Ⅰ组要求末次使用甲基苯丙胺时间不大于24 h，尿液检测甲基苯丙胺阳性；试验Ⅱ组要求甲基苯丙胺成瘾者戒毒康复6 ～7 个月（180 d ～210 d）；对照组要求性别年龄与试验组受试者相匹配，同性别、年龄相差不超过3岁，来源于医院体检或招募的无药物滥用史的健康受试者。收集样本信息见表1。

本研究经北京大学生物医学伦理委员会审阅并获批准，参加试验患者均签署了知情同意书，同意参加本试验。

2 方法与结果

2.1 样品制备

将血清、尿液或血浆样品在4 ℃下解冻并涡旋10 s。

血清：取冷却至4 ℃的甲醇-丙酮（9∶1）300 μL加入血清样本100 μL中，剧烈涡旋3 min，并在4 ℃下，以14 000 r/min 离心15 min。取上清液100 μL在真空离心浓缩仪中挥干，并在-80 ℃下保存。用水-乙腈（9∶1）100 μL 复溶残渣，涡旋3 min，在4 ℃下，以14 000 r/min离心15 min，取上清液进样。

血浆：取冷却至4 ℃的甲醇-丙酮（9∶1）150 μL加入血浆样本50 μL 中，剧烈涡旋3 min，后续前处理方法同血清样品。

尿液：取冷却至4 ℃的甲醇-水（1∶1）100 μL 加入尿液样品50 μL 中，涡旋振荡3 min，在4 ℃下以14 000 r/min离心15 min，取上清液进样。

QC：血清、血浆和尿液样品各取40 μL，分别混合后等份分装，处理方法同样品，制备成血清、血浆和尿液QC样品。

2.2 LC-QTOF-MS分析

2.2.1 色谱条件 采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相A为水-乙腈-甲酸（95∶5∶0.1），B 相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。尿液线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（95∶5）→2 min（95∶5）→23 min（70∶30）→37 min（10∶90）→42 min（10∶90）→43 min（95∶5）→50 min（95∶5）。血浆和血清线性洗脱条件（A∶B）：0 min（95∶5）→2 min（95∶5）→30 min（10∶90）→35 min（10∶90）→36 min（95∶5）→44 min（95∶5），流 速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃，尿液和血浆样品进样量为10 μL，血清样品进样量为5 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾电离（ESI）源在正电离和负电离模式下运行。质谱参数如下：正电离模式喷雾电压4.0 kV，负电离模式喷雾电压-3.0 kV，雾化气体流量为3.0 L/min，干燥气体流量为10.0 L/min，加热气体流量10.0 L/min，接口温度300 ℃。使用氩气进行碰撞诱导（CID）。MS 数据采用数据依赖采集（DDA）模式进行记录。在开始分析批次之前，将QC 样品连续测定5 次，批次间每测定6 个样本后分析1次QC样品。

2.3 数据处理

将采集得到的LC-QTOF-MS 数据用数据处理软件（SignpostTMMS 2.1.3）进行前处理，去噪音、峰对齐、峰合并和归一化提取峰信息。按照80%规则对导出数据进行共有峰筛选和缺少值填补。经预处理的数据进行单变量（t 检验）和多变量分析（PLS-DA 和OPLS-DA），多变量分析后的模型需经过200 次置换检验，左侧所有的Q2和R2均需小于右侧的原始值，则证明模型有效，未过度拟合。

2.4 统计分析

根据LC-QTOF-MS（ESI+）数据，PLS-DA的二维得分图如图1 所示。血浆（图1-A），血清（图1-B）和尿液（图1-C）的PLS-DA 得分图可以清楚地将甲基苯丙胺急性期组、康复期组和健康组3组分开。

根据LC-QTOF-MS（ESI-）数据，PLS-DA 的二维得分图和三维得分图如图2 所示。血清的PLS-DA的二维得分图可以清楚地区分3组，血浆和尿液的PLS-DA 的二维得分图无法将3 组完全分开，但是三维得分图可以清楚地将甲基苯丙胺急性期组、康复期组和健康组3组分开。

2.5 潜在生物标志物筛选

为了筛选出更加可靠的潜在生物标志物，将单变量分析和多变量分析相结合。潜在的生物标志物需满足以下条件：（1）根据OPLS-DA 模型中投影变量重要性VIP（变量VIP ＞1 被认为对分组具有重要贡献）筛选出差异物；（2）通过S-plot（|p（corr）|＞0.5，|p|＞0.1，ESI+和ESI-模式下结果分别见表2、表3）检验上述差异物的可靠性；（3）最后通过t 检验进一步验证（P ＜0.05 被认为是统计学差异，见图3）。

2.6 生物标志物的鉴定

根据筛选出的潜在生物标志物的离子特征，选择质子化的分子和/或其他丰度最高的加合物离子作为前体离子进行MS/MS 分析。将得到的MS/MS 谱图与人类代谢组数据库（HMDB）中的参考标准比较。在LC-QTOF-MS（ESI+）模式下，分别从血浆、尿液和血清中鉴定出11，4 和2 个差异代谢物（表2），LC-QTOF-MS（ESI⁻）模式下，分别从血浆、尿液和血清中鉴定出7，2 和1 个差异代谢物（表3）。

Figure 1 PLS-DA score plots of plasma(A),serum(B)and urine(C)detected by LC-QTOF-MS(ESI+)A:R2X=0.401,R2Y=0.852,Q2=0.721;B:R2X=0.416,R2Y=0.828,Q2=0.624;C:R2X=0.204,R2Y=0.708,Q2=0.386

与健康组相比，甲基苯丙胺急性期组血浆中溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0∶0），LysoPC（18∶2（9Z，12Z）/0∶0），LysoPC（16∶0）/0∶0），LysoPC（18∶1（9Z）/0∶0），尿中3-羟基-3-（4-羟基苯基）丙酸水平升高；血浆中鞘磷脂（SM）（d18∶1/16∶0），三氟乙酸和溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）（20∶2（11Z，14Z）/0∶0），血清中反式-S-（1-丙烯基）-L-半胱氨酸，LysoPC（18∶2（9Z，12Z）/0∶0），尿中3-羟基壬酰基肉碱水平降低。与健康组比较，甲基苯丙胺康复期组血浆中L-肉碱，尿中硫酸盐水平升高；血浆中LysoPE（20∶2（11Z，14Z）/0∶0），LysoPE（20∶0/0∶0），LysoPE（18∶0/0∶0），三氟乙酸，3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸，尿液中孕二醇在水平降低。

与康复期组相比，甲基苯丙胺急性期组血清中LysoPE（22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z）/0∶0），血浆中LysoPC（18∶1（9Z）/0∶0）、LysoPC（16∶0/0∶0）、LysoPC（18∶2（9Z，12Z）/0∶0）、血小板激活因子和LysoPC（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/0∶0），尿中3-羟基壬酰基肉碱水平升高；尿中雌酮水平降低。

2.7 代谢通路分析

根据表2 和表3 所示的潜在生物标志物，应用MetaboAnalyst 5.0进行代谢物富集分析，筛选出了可能受到影响的相关代谢途径（见图4、图5）。甲基苯丙胺急性期组血浆中的SM（d18∶1/16∶0）水平降低，LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）水平上调，提示脂质代谢紊乱；康复期组L-肉碱合成增强，脂肪酸代谢增强，提示能量代谢异常；硫酸盐水平显著升高，硫酸盐/亚硫酸盐代谢异常；尿中孕二醇水平降低，性激素代谢异常。

流行病学研究表明，精神症状的发作可能与性激素的分泌变化有关［24-25］。孕二醇是孕激素的主要代谢产物，首次被报道为精神分裂症的生物标志物［26］。甲基苯丙胺诱发的精神症状通常与精神分裂症患者的急性精神病发作的临床症状难以区分，可能有共同的发病机制［27］。本研究发现，与健康组相比，甲基苯丙胺康复期组尿中孕二醇水平下调，与康复期组相比，急性期组雌酮水平上调，这一现象可能与甲基苯丙胺成瘾引起的精神症状有关，分析原因为甲基苯丙胺长期作用于中枢神经系统，对神经系统产生损伤，进而诱发了精神症状，未来可通过研究该潜在生物标志物具体的作用机制，明确甲基苯丙胺成瘾与精神分裂症之间的关系。

Figure 2 PLS-DA score plots of plasma(A),urine(B)and serum(C)detected by LC-QTOF-MS(ESI-)A:R2X=0.323,R2Y=0.931,Q2=0.732;B:R2X=0.252,R2Y=0.297,Q2=0.101;C:R2X=0.355,R2Y=0.69,Q2=0.539

脂质代谢紊乱可能与精神分裂症有关，另外其在心血管疾病和糖尿病的发病机制中也起着至关重要的作用，脂质可能是连接精神分裂症和代谢综合征的重要生物标志物［26］。SM 是一类存在于细胞膜内的脂质，参与许多细胞过程的调控，包括细胞凋亡［28］，SM 代谢的紊乱对信号传导和神经系统具有重要影响。LysoPC 主要由磷脂酶A2 催化磷脂酰胆碱而来，与多种神经系统疾病和心血管疾病之间都存在有密切的联系，如精神分裂症、阿尔茨海默病和糖尿病等［29］。血小板激活因子是一种磷脂炎症因子，其在血浆中水平的上升与中枢神经系统的损伤之间存在密切联系［30］。本研究中，相比于健康组，甲基苯丙胺康复期组血浆中SM（d18∶1/16∶0）下调，急性期组LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）上调；相比于康复期组，急性期组血小板激活因子、LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）上调。此外，上述4 种LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）在甲基苯丙胺康复期组与健康组之间没有显著差异，这表明上述LysoPC（16∶0，18∶2，18∶1，20∶4）在甲基苯丙胺康复期可能已恢复到正常水平。这些脂类物质的改变，表明机体脂质代谢紊乱。这些物质可能与甲基苯丙胺成瘾引起的精神症状和心血管等疾病有关，但甲基苯丙胺诱发这些疾病的具体机制还不清楚，后续可通过作用机制的研究，找到甲基苯丙胺成瘾与这些疾病的关系。

Table 2 Identified metabolites detected by LC-QTOF-MS(ESI+)

Table 3 Identified metabolites detected by LC-QTOF-MS(ESI⁻)

3 结 论

本研究采用LC-QTOF-MS 技术对甲基苯丙胺成瘾者、戒毒康复者和健康人的血浆、血清和尿液进行分析，观察其代谢轮廓，发现了一些潜在的生物标志物。总的来说，上述潜在生物标志物暗示了甲基苯丙胺成瘾者的脂质代谢紊乱以及甲基苯丙胺戒毒康复者硫酸盐/亚硫酸盐代谢、脂质代谢和性激素代谢紊乱。本研究发现甲基苯丙胺康复期孕二醇和甲基苯丙胺急性期LysoPC 水平异常，可能与甲基苯丙胺成瘾引起的精神症状有关。本研究为甲基苯丙胺临床戒毒分期的科学判断提供了可能性，但由于样本量较小，而潜在标志物可能会受到许多因素的影响，有必要对这些结果进行进一步验证，并对其潜在机制进行更深入的研究。

Figure 3 Column bar graphs (mean with SD)for significantly changed metabolites detected by LC-QTOF-MS in plasma (A)and serum (B)and urine(C)Significance level is indicated with asterisks*P＜0.05; **P＜0.01;***P＜0.001; ****P ＜0.0001

Figure 4 Metabolite set enrichment analysis of potential biomarkersA:Metabolite set enrichment analysis of potential biomarkers between MAMP recovery group and healthy group;B:Metabolite set enrichment analysis of potential biomarkers between MAMP acute group and recovery group. P-value (more than expected by chance within the given compound list); Enrichment Ratio=Observed hits/Expected hits.

Figure 5 Summary of metabolic pathways related to potential biomarkers. Box indicates the potential biomarkers. Orange-colored symbols indicate up-regulations of metabolites in acute group or recovery group compared with healthy group and acute group compared with recovery group,while bluecolored symbols indicate down-regulations