培养基优化对提高莫勒菌产孢量的影响

邱振兴， 熊津名， 蔡少芬， 邱君志， 陈宇熹

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室， 福建福州 350002)

化学杀虫剂在控制农业有害生物、保护农业生产方面发挥了重要的积极作用，但其长期大量、不合理使用带来了环境污染、食品安全和昆虫抗性等一系列问题(Casidaet al，2017；Yigitet al，2020)。 因此，人们把注意力转向害虫生物防治 (Richardsonet al，2019； Sequeira，2019)。 昆虫病原真菌可用于刺吸式口器害虫粉虱和介壳虫的生物防治。 昆虫病原真菌孢子在芽管萌发后会侵染害虫，通过穿透寄主体表、破坏昆虫血腔、产生多种毒素和摧毁免疫系统等方式侵染寄主并在其群体中传播流行，进而控制寄主群体(Shinet al，2020)。 在近1 000 种昆虫病原真菌中，莫勒菌属(Moelleriella)能高度专一地寄生粉虱和蚧类，因此大量生产该菌孢子并加以应用值得深入研究。

在莫勒菌生产中，培养基的配方直接影响孢子产量和制剂致病力(Maet al，2020； Diaset al，2021)，因此，培养基配方的筛选和优化便显得尤为重要。 一般菌株在基础培养基上仅能获得较低水平的产孢量，大多研究者通过单因素试验、正交试验和响应面效应法来优化产孢培养基的配方，旨在显著提高孢子产量(Jianget al，2020)。 由于不同菌株对营养需求有所差异，本研究基于前期单因素筛选的结果，进一步采用正交试验，优化莫勒菌培养基组成成分(碳源、氮源、金属离子和维生素)，达到提高产孢量的目的，同时为该菌今后工业化大量生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为拉瑟波斯基莫勒菌(Moelleriella raciborskiiLiu，Chaverri ＆ Hodge)，由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室分离自福建省三明沙县感病柑桔粉虱，纯化、鉴定后保存备用。

基础培养基原料为硫酸铵2 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、磷酸氢二钠0.65 g、磷酸二氢钾0.5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，并设为对照。 分离和保存菌株用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 15～20 g、蒸馏水 1 L、自然 pH)。

1.2 试验方法

在基础培养基中，分别加入不同碳源、氮源、金属离子、维生素，在培养基中的浓度分别为7 g·L-1、10 g·L-1、4×10-4mol·L-1、50 mg·L-1，基于 4 因素 3 水平 L9(34)设计正交试验(表 1)。

表1 培养基配方优化正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for optimization of the medium composition

1.2.1 孢子悬液的制备及浓度测量 将拉瑟波斯基莫勒菌转接至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在23±1 ℃下培养10～14 d。 加入0.05%的吐温-80 无菌水 10 ～15 mL 至已产孢的培养皿中，在磁力搅拌器的驱动下使橙色粘孢团均匀分散在溶解液中而获得孢子液，用显微镜试纸过滤除去杂质和残存的菌丝，然后借助血球板计数器测量孢子数目并算出其浓度。

1.2.2 孢子产量的测试 在直径为9 cm 的培养皿中倒入20 mL 不同组合的培养基，当各培养基凝固后分别在每皿中接种3×107孢子·mL-1的孢子液0.5 mL，用无菌玻璃刮刀均匀涂布孢子液后，在23 ℃下培养14 d。 在已充分产孢培养基上加入0.05% 吐温-80 无菌水10 mL，用玻璃刮刀刮取所产孢子，用显微镜试纸过滤后获得孢子液，基于血球板计数器计数，设置3 个重复，计算其平均孢子产量。

1.3 数据分析

利用SPSSAU 软件对试验数据进行处理，借助SPSS 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SPSSAU 软件进行正交试验设计的极差分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

由表2 可知，与对照的产孢量(0.02×108孢子·cm-2)相比，最有助于莫勒菌产孢的培养基组合是 7(A3B1C3D2，7 g·L-1甘露醇、10 g·L-1酵母浸粉、4×10-4mol·L-1Fe2＋、50 mg·L-1VC)，产孢量可达 1.09×108孢子·cm-2；其次是组合 4 和 6，其孢子产量分别为 0.87×108和0.90×108孢子·cm-2；孢子产量最低的为组合 2，其产孢量为0.05×108孢子·cm-2，因此经正交试验优化后的培养基能显著提高莫勒菌孢子产量。

表2 莫勒菌孢子产量的正交试验结果Table 2 Moelleriella raciborskii sporulation obtained in the orthogonal matrix experiment

2.2 正交试验极差分析

表 2 中的K1、K2 和K3 分别代表水平 1、2、3 对应的产孢量之和，极差R表示K1、K2 和K3中的极大值与极小值间的差值。 从极差R值可见，碳源种类差异对产孢影响最大(5.94)，其次是不同种类的维生素对产孢量的影响(3.69)，对产孢量影响最小的是不同种类的金属离子(1.26)。 由此可见，不同营养要素对该菌产孢量影响差别较大，这为优化莫勒菌培养基成分增加产孢量提供了参考。

2.3 产孢验证试验

基于正交试验分析结果，配置最佳组合 A2B1C3D2 培养基(7 g·L-1可溶性淀粉、10 g·L-1酵母浸粉、4 × 10-4mol·L-1Fe2＋、50 mg·L-1VC)， 培 养 后 莫 勒 菌 产 孢 量 可 达1.2×108孢子·cm-2，而该菌在优化前的基础培养基(对照)上产孢量仅为0.02×108孢子·cm-2，较优化前孢子产量提高60 倍。 因此，进一步佐证了基于正交试验优化的培养基能够大幅度增加产孢量，可为大批量生产该菌提供科学依据。

3 结论与讨论

本研究表明，最有利于莫勒菌产孢的碳源、氮源、金属离子、维生素分别是7 g·L-1可溶性淀粉、10 g·L-1酵母浸粉、4×10-4mol·L-1Fe2＋、50 mg·L-1VC。 其中碳源对产孢量影响最大，其次是维生素、氮源对产孢量的影响，相对而言金属离子对产孢量影响最小；优化后的培养基能显著提高莫勒菌产孢量。

据此，不同种类碳源对产孢量的影响最大是否关系到真菌的碳代谢，不同二价金属离子对产孢量的影响较小是否与金属价键有关，这些需要深入研究。 因此后期可开展该菌碳代谢及其与产孢关系的分子机理研究。 此外，真菌往往在不同发育阶段对各种营养需求存在差异，该菌不同生长阶段对营养需求如何还需进一步试验验证。

本试验为昆虫病原真菌莫勒菌大量生产提供了一定的参考信息，但是该菌在靶标害虫体内的营养需求情况尚待深入研究，便于揭示其昆虫致病机理，进而更好用于害虫生物防治。 同时需对正交试验进行方差分析，应用响应面分析法(response surface methodology，RSM)更精准优化产孢营养需求。