宏基因二代测序在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用

上官丽娟，王海龙，尚 晶，王智军，侯苗苗，薛岚平

中枢神经系统感染性疾病病原体复杂，病程进展凶险，如何更快、更准明确病原体一直是诊断难点。传统诊断方法中，脑脊液培养阳性率低，PCR技术在无特定提示情况下，难以发挥作用。近年来，宏基因组二代测序技术逐渐发展，2014年国际上报告了首例使用mNGS诊断神经感染的病例。我国自2015年开始出现相关研究的报道。该技术具有无需对标本进行预处理及无偏倚测序的优点，可以对标本中所有的病原体核酸进行检测，在临床中的应用逐渐受到关注，尤其是对一些病因不明的患者。但由于mNGS检测流程复杂，涉及环节多，结果解读尚缺乏统一规范，检测结果易受多种因素影响，易出现与最终诊断不符的情况。本研究基于mNGS对常见中枢神经系统感染病原体检出情况的分析，结合临床，探讨mNGS在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2019-01至2021-12山西省白求恩医院神经内科收治的中枢神经系统感染患者85例为研究对象。诊断标准参考《神经内科疾病诊断标准》。入组标准：(1)存在脑膜炎、脑炎或脑脊髓膜炎临床表现或体征；(2)脑脊液性状提示炎性反应；(3)完成mNGS和相关传统检测。排除标准：(1)拒绝腰穿或存在腰穿禁忌证；(2)肿瘤、自身免疫性脑炎、风湿免疫性疾病患者；(3)妊娠；(4)其他不适宜入组的情况。本研究通过山西白求恩医院伦理委员会批准，遵从赫尔辛基宣言，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料来源 回顾研究对象的临床资料，建立格式化信息采集表，采集患者的一般资料、临床特征、传统检测结果、mNGS检测结果及预后转归信息，并进行结构化处理。

1.2.2 样本采集与检测 入选患者均行腰穿检查，遵循腰椎穿刺标准化操作规范，除留取脑脊液常规、生化、涂片、培养及相关抗体检测等项目外，另留取2～3 ml 脑脊液样本，保存在无菌管中密封，-20 ℃储存并干冰运输至华大医学检验公司行mNGS检测及数据分析。同时留取患者的全血，由本单位中心实验室完成血清特异性抗体检测和(或)血培养。

1.2.3 mNGS判读与质控 测序深度20 M，阳性：覆盖正常，(1) 病毒：检出序列数覆盖到病毒参考基因组上≥3个不重叠的区域，则报告检出该病毒；(2)对于细菌、真菌和寄生虫，考虑微生物基因组大小的不同，首先将检测到的序列标准化为每兆数据量检测到的序列(reads per million, RPM)，然后计算临床标本和阴性质控(NTC)的RPM的比值(RPM-r)。当RPM-r≥10，则报告检出该病原体，否则报告没有检出。

1.2.4 相关定义 最终诊断为出院诊断或死亡诊断，结合临床拟诊、传统病原学检测、辅助检查(包括腰椎穿刺脑脊液常规检测、头部影像学检查和脑电图检查等)结果综合判断。传统方法为脑脊液涂片、脑脊液培养、PCR、相关抗体检测及血培养等传统检测及典型头部影像学表现。以最终诊断为金标准。准确率计算公式为mNGS阳性病例与最终诊断相符患者例数占总纳入例数的比例。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件包进行分析，计数资料采用率(%)表示，两组准确率的比较采用率的检验，以<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 85例中，男44例，女41例，年龄14～77岁，平均(43.04±16.86)岁。临床症状主要表现为发热、头痛、呕吐、意识障碍及精神行为异常，颅脑影像多提示脑膜受累或脑脊髓组织受累(12/85)。74例病情好转，10例预后较差或死亡，1例二次复发。11例预后不良患者中5例检测时间存在延误，2例无法明确病原体，2例病毒感染后合并周围神经损害，1例病毒感染后继发自身免疫性脑炎。

2.2 mNGS病原体检出情况 85例患者中共检出21种病原体，部分病原体最终判读为与临床情况不符，分别为3例金黄色葡萄球菌、1例EBV、1例庚型肝炎病毒、1例水痘带状疱疹病毒、1例铜绿假单胞杆菌、1例弗氏柠檬酸杆菌及1例提蒙普雷沃菌，其余检出结果与最终诊断相符。检出情况见图1。

红色代表检出结果与最终诊断不符，蓝色代表检出结果与最终诊断相符

2.3 mNGS与传统方法检测病原的比较 85例中，mNGS检出阳性57例，其中与最终诊断符合48例，不符合9例；传统方法检出阳性23例，其中与最终诊断符合22例，不符合1例。两种方法准确率分别为56.5% (48/85)及25.9%(22/85)，两种方法准确率差异有统计学意义(=16.42，<0.001)。中枢神经系统感染性疾病患者mNGS与传统诊断方法的检出结果见表1。

进一步亚组分析，细菌组27例，mNGS检出阳性20例，其中与最终诊断符合19例，不符合1例，准确率70.4%；传统方法检出阳性8例，其中与最终诊断符合7例，不符合1例，准确率25.9%。病毒组36例，mNGS检出阳性22例，与最终诊断符合17例，不符合5例，准确率47.2%；传统方法检出阳性6例，均与最终诊断相符，准确率16.7%。结核组20例，mNGS检出阳性13例，其中与最终诊断符合10例，不符合3例，准确率为50.0%；传统方法检出阳性7例，均与最终诊断相符，准确率35.0%。因梅毒螺旋体及真菌感染各1例，归为其他组，不做分析。在前3个亚组中，结核组两种方法准确率无统计学差异，细菌和病毒感染组准确率差异有统计学意义(表2)。

3 讨 论

中枢神经系统感染性疾病是神经系统常见急危重症，及早诊断、尽快治疗的关键在于快速确定病原体。传统诊断模式首先依赖患者的病史、查体和影像学特点确定拟诊病原体，然后进行脑脊液常规、生化、涂片、PCR、脑脊液培养及血培养等传统检测，单一传统检测方法准确率低，可检病原体有限，联合检测操作复杂、耗时长，容易延误治疗。而mNGS因其无偏倚测序的优点，可以对标本中所有的病原体核酸进行检测，能更好地提高准确率，同时保证时效性。本研究中85例患者mNGS检出致病病原体的比例为56.5%，传统方法为25.9%，mNGS优于传统方法，准确率与我国《中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识》中提到的准确率接近。具体到每一例阳性患者致病病原体检出方面，mNGS单独检出31例，传统方法单独检出5例，两者共同检出17例。mNGS病原体检出能力优于传统方法，提示对疑似感染而传统方法无法明确病原体的患者，可将mNGS作为传统方法的有利补充手段。

进一步亚组分析，在细菌感染组中，mNGS较传统方法的优越性尤为突出，传统方法无单独检出病例，mNGS额外检出了11例，其中9例前期已接受经验性抗感染治疗。既往研究表明，病原体培养容易受到抗菌治疗的影响，抗生素治疗后患者脑脊液培养准确率可降至9%～11%，而高通量测序只需要识别微生物微量的DNA片段，抗生素治疗后病原体仍有较高的准确率。该文进一步指出，当经验性抗感染治疗超过4 d后，mNGS的准确率也会受影响。本研究发现，mNGS补充传统方法同样适用于病毒感染患者。对于结核分枝杆菌等胞内菌感染，现有检测手段有限，在传统检测结果为阴性时，是否需要长时间抗结核治疗，经常是临床医师十分困惑的问题，本文结核组患者因例数较少，mNGS检测准确率较传统方法无统计学差异，但是准确率已显示一定趋势，提示未来mNGS或可为结核杆菌的检出提供一定的技术支撑，本研究3例结核患者通过mNGS检测得以确诊，调整治疗方案后预后良好。

本研究mNGS与传统方法同时阳性的比例为20.0%，较共识偏低，这可能与传统方法阳性率偏低及传统方法不够深入全面有关。本研究mNGS检测结果中有9例判读为与最终诊断不符，涵盖了EBV、庚型肝炎病毒等病原菌，其中金黄色葡萄球菌3例。关于EBV感染，Fan等指出EBV多数情况下不是致病病原体，对阳性结果判读应慎重，中国专家共识及Xing团队进一步提出部分DNA病毒可在CNS中潜伏，判读应结合临床。不符结果中最多见的为铜绿假单胞杆菌及金黄色葡萄球菌，Xing等指出细菌性脑膜炎常见病原体(如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等)可能是非细菌性脑膜炎患者的mNGS假阳性，而许多类似报道亦表明对于检出病原体为疑似背景污染或医院环境中广泛存在的微生物时，判读结果要慎重。本研究mNGS未检出病原体的比例为43.6%，病毒及结核感染组的检出比例较整体更低。有研究指出由于RNA检测的缺失，mNGS不能显著预测病毒性脑炎和/或脑膜炎，必须改进DNA/RNA共提取方法，以提高其准确率。对结核等胞内菌感染患者，目前mNGS主要采用脑脊液上清进行检测，而胞内菌破壁相对困难，因此检测时很可能遗漏部分胞内感染的核酸信息，导致准确率低。此外，若宿主对病原体产生的免疫反应强烈，脑脊液样本中白细胞计数增多，促使样本中人源核酸比例升高，从而降低病原体的检出，亦会导致检测结果为阴性。综上，目前检测结果为阴性可能与核酸提取方法相对简单、胞内菌检测时破壁受限核酸信息释放不充分以及宿主免疫反应过强干扰病原体核酸信息提取等因素有关。

总之, mNGS在中枢神经系统感染性疾病病原体诊断方面的优越性十分突出，下一步临床应用中我们应多积累经验，不断优化mNGS的使用。当然，本研究为单中心研究，每一类病原体例数相对较少，尤其是关于真菌及梅毒螺旋体方面的研究，后续将不断扩大样本，进一步分类研究。另外，因本研究按入排标准，筛除了部分非中枢神经系统感染性疾病患者，欠缺对mNGS在中枢神经系统感染性疾病患者诊断效能的深入验证。后期我们将纳入所有进行mNGS的患者对此进行探究。