HPLC-Q/Orbitrap HRMS快速筛查和确证液体乳中59种农药残留

张申平，周静，杜茹芸，徐红斌，刘洋

(上海市质量监督检验技术研究院 国家市场监管重点实验室（乳及乳制品检测与监控技术），上 海200233)

0 引言

液体乳含有丰富的营养物质，种类繁多的液体乳产品备受消费者喜爱。但近年来液体乳中农药[1-3]、兽药[4-6]、有机污染物[7]残留已经敲响了液体乳质量安全警钟。液体乳的农药残留往往容易被忽视，这是因为饲料中的农药经过奶牛消化吸收后，进入奶中的浓度较低，但这种微量、长期性的毒害势必影响人体健康[8-9]。各国已然制定了液体乳中农药残留的最大限量值，欧盟规定了奶中460余种农药的限量值，其中林丹的限量值低至0.001 mg/kg；美国规定了牛奶中190余种农药的最大限量值，乐果的限量值低至0.002 mg/kg；日本规定了奶中300余种农药的限量值，部分农药一律不得检出。我国的GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[10]已将牛乳中农药残留限量增加至125项。

液体乳中脂肪含量高、基质复杂、农药含量低，因此需要更加高效的样品前处理及仪器方法。目前主要的检测方法有气相色谱法[11-13]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[14-16]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[17-19]，主要集中在单一类别农药的检测。近年来高分辨质谱在农药残留分析方面的应用日益增多，高分辨质谱相对于常规HPLC-MS/MS具有更高的分辨率，在痕量组分的分析中具有独特优势，以一级质谱精确质量数、保留时间、同位素丰度比和二级特征离子为筛查条件，可以快速完成复杂样品中痕量物质的筛查和确证。黄合田[20]等人建立了Sin-QuEChERS结合超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法快速非靶向筛查绿茶中38种农药及其代谢物残留的分析方法。孟志娟[21]等建立了气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱同时筛查农产品中70种农药残留的方法。吴洁珊[22]等人建立气相色谱高分辨飞行时间质谱法快速筛查水果中283种农药残留量的分析方法。液体乳基质复杂，常规样品提取液净化方法难以实现痕量物质的分析，新型的Captiva EMR-Lipid小柱可通过体积排阻和疏水作用捕获脂质，使体积较大的物质被阻止在外，达到净化目的。张崇威[23]等人利用Captiva EMR-Lipid固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱同时分析猪肉、鸡肉、鸡蛋中51种药物残留。胡巧茹[24]等人用Captiva EMR-Lipid小柱净化，建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查和确证粮谷产品中20种真菌毒素的方法。肖晓峰[25]等人对比分析了QuEChERS dSPE EMRLipid试剂盒和Captiva EMR-Lipid试剂盒对橄榄油食品模拟物中7种对苯二甲酸酯或苯甲酸酯的净化效果。目前还未见Captiva EMR-Lipid小柱在液体乳农残检测中的应用报道。

本文利用Captiva EMR-Lipid小柱的超强净化作用和静电场轨道阱高分辨质谱建立液体乳中59种农药残留的液相色谱-高分辨质谱分析方法。涵盖了有机磷类、有机氯类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类等农药；采用全扫描和二级质谱扫描相结合的方式，方便数据回溯；利用基质匹配标准溶液定量，降低了背景干扰，分析方法的各项参数可以满足液体乳中农药残留的检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Q Exactive PLUS四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱及Vanquish VF-P10-A高效液相色谱联用系统，美国Thermo公司；电子天平，梅特勒-托利；5804离心机；涡旋振荡器，德国heidolph；超纯水器，MILLIPORE；Captiva EMR-Lipid净化柱（6 mL，600 mg），美国Agilent公司；Thermo Accucore VDX色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），美国Thermo公司；Cleanert S C18净化柱和Cleanert MAS-Q dSPE净化管，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

乙腈、甲醇（色谱纯），美国Thermo公司；乙酸铵（分析纯，≥98%）、甲酸（Aladdin，色谱级，≥98%），国药集团化学试剂有限公司；萃取盐包（QuEChERS Extract Pouch，EN Method，4 g硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠二水合物，0.5 g柠檬酸氢钠），美国Agilent公司。

农药标准品：59种农药混合标准品购自月旭上海科技有限公司，浓度50μg/mL（乙酸乙酯）。

1.2 样品前处理

称取5 g牛奶（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈，同时加入萃取盐包，涡旋混匀1 min，剧烈振荡5 min。待离心管冷至室温后，5 000 r/min离心2 min，取5 mL上清液于10 mL离心管中，加入1 mL超纯水，轻微振荡混匀。将混合液直接上样至Captiva EMR-Lipid净化柱，仅靠重力作用净化，用1.5 mL乙腈-水（8∶2）混合溶剂冲洗净化柱，结束后用洗耳球排空净化柱。取3 mL流出液于40℃氮吹浓缩至1 mL，过0.22μm滤膜，上机测试。

1.3 标准溶液配制

基质匹配标准工作溶液配制：按照1.2的样品前处理方法处理空白基质样品，得到空白基质提取液，配制浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/kg的基质匹配标准工作溶液，该工作液应现配现用。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

Thermo Accucore VDX色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），柱温：30℃，流速：0.4 mL/min，流动相A：5 mmol乙酸铵0.1%甲酸水溶液，流动相B：5 mmol乙酸铵0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱程序：0～4 min，0～20%B；4～5.5 min，20%～40%B；5.5～10.5 min，40%～100%B；10.5～12.9 min，100%B；12.9～15 min，100%～0 B。

1.4.2 质谱条件

离子源：可加热电喷雾离子源（HESI）；离子源温度：325℃；喷雾电压：3.60 kV；透镜电压：50.0 V；鞘气流速：40 arb；辅助气流速：10 arb；辅助气温度：350℃；质量分析器：Orbitrap；扫描模式：Full MS-ddMS2；采集范围：120.0～1500.0 m/z；一级质谱分辨率为70 000 FWHM；C-trap最大容量（AGC target）：1×106；C-trap最大注入时间：200 ms；二级质谱分辨率17 500 FWHM；C-trap最大容量（AGC target）：2×105；C-trap最大注入时间：60 ms；归一化碰撞能（NCE）：20/40/60 eV；动态排除：8.0 s。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

利用一级质谱全扫描的母离子精确质量数对应的色谱峰峰面积进行定量分析，全扫描范围为120.0～1 500.0 m/z，利用保留时间和二级质谱的特征离子进行定性分析，根据响应强度，每个化合物指定两个定性离子。黄合田[20]等人在高分辨质谱快速筛查绿茶中农药及代谢物的研究中发现，乙硫甲威和灭虫威的精确质量数相同，但可通过不同的保留时间和特征碎片离子（乙硫甲威：107.04927，灭虫威：121.06472）进行区分。以Orbitrap作为质量分析器的质谱系统，其一级质谱的分辨率可达140 000，可以保证实测质量数和理论质量数之间的相对偏差足够小，排除假阳性结果。孟志娟[21]等人报道当质谱分辨率低于60 000时，嘧霉胺的定性离子m/z 199.11049与干扰离子m/z 199.09990无法分开，容易造成假阳性结果。本研究中将一级质谱分辨率设置为70 000，二级质谱分辨率为17 500，相对质荷比偏差阈值设定为5×106。

2.2 色谱条件的优化

流动相的pH、是否添加缓冲盐及不同的色谱柱对液相色谱分离化合物的效果至关重要。本研究比较了Thermo Accucore VDX色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）和Thermo Accucore C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6μm）。结果表明，农药化合物在两根色谱柱上均有保留，但C18柱对部分化合物的响应略低，如四螨嗪和双苯氟脲对应的峰面积仅为VDX柱峰面积的50%。流动相的pH及缓冲盐影响目标化合物的离子化效率和分析灵敏度，分别考察了以甲醇、乙腈、5 mmol乙酸铵0.1%甲酸甲醇对目标物的分析灵敏度。发现以甲醇为流动相，基质匹配工作液中的氟虫酰胺和丙硫菌唑未出峰；以乙腈作为流动相，咪唑菌酮和敌敌畏的响应值明显降低，相比于5 mmol乙酸铵0.1%甲酸甲醇流动相，降低10倍。本研究采用梯度洗脱程序，15 min内，各化合物均能得到较好分离。基质匹配标准工作液中部分化合物的提取离子流图如图1所示。

2.3 前处理方法优化

在提取液中加入适量有机酸，有利于提高氨基甲酸酯类农药的回收率[26-28]。本研究涉及的农药极性范围广，提取液的选取对回收率至关重要。分别考察了乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈对59种农药的回收率，结果如图2所示，随着提取液中甲酸含量的增加，回收率＜70%的农药个数减少，回收率＞120%的农药个数增加，当提取液中甲酸浓度为0.2%时，回收率在70%～120%之间的农药个数为51个，回收率＜70%和回收率＞120%的农药个数分别为1和7个。

液体乳样品提取液的净化对农药残留检测至关重要。本研究比较了Captiva EMR-Lipid净化柱、Cleanert S C18净化柱和Cleanert MAS-Q dSPE净化管对液体乳样品的净化效果，采用Full MS模式采集净化液的质谱信息。结果如图3所示，Captiva EMRLipid净化柱有效地隔绝了提取液中干扰物质的流出，净化效果最优，而Cleanert MAS-Q dSPE净化管几乎没有净化效果。

2.4 基质效应

色谱分析中与目标物共流出的干扰组分会产生基质效应（Matrix Effect，ME），影响分析方法的灵敏度和定量结果的准确性。基质效应通常以目标物在基质匹配标准溶液和纯溶剂标准溶液中响应值的差异程度进行评估，一种方法[29]是比较目标物峰面积，另一种方法[30]是比较基质匹配标准曲线的斜率和纯溶剂标准曲线的斜率，后者可以更为全面地体现基质效应。本研究以基质匹配标准曲线斜率对纯溶剂标准曲线斜率的相对偏差表示基质效应，作为ME值。若ME＜10%，基质效应可忽略不计；ME值在10%～20%之间，则存在弱基质效应；ME值＞20%，存在强基质效应。

实验结果表明，54种农药的ME≤10%，咪唑烟酸、灭蝇胺的ME＞20%，多菌灵、氯氰菊酯、氟苯虫酰胺的ME值在10%～20%之间，可见90%以上的农药受基质影响较小。为进一步降低基质的影响，本研究采用基质匹配标准曲线定量。

2.5 方法评价

基质匹配标准曲线中以峰面积（y）对质量浓度（x）作图，得到各农药的标准曲线。各农药化合物在0.005～0.1 mg/kg范围内线性良好，相关系数R＞0.99。对浓度为0.005 mg/kg的标准溶液进行逐级稀释后进样测试，根据3倍信噪比（S/N=3）估算检出限（LOD），10倍信噪比（S/N=10）估算定量限（LOQ）。其中甲拌磷、塞普洛、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐B1A的定量限分别为0.012 mg/kg、0.0007 mg/kg和0.003 mg/kg，略高于GB 2763-2019国家标准中对牛乳规定的0.01 mg/kg、0.0004 mg/kg和0.002 mg/kg，其余农药化合物的定量限均在0.0007～0.017 mg/kg之间，满足国家标准中0.004～1 mg/kg的限量规定。加标回收实验中3个加标浓度分别为0.005、0.02和0.05 mg/kg，每个浓度重复测定6次。以加标浓度为0.02 mg/kg的样品为例，除双甲脒回收率偏低，其余农药化合物的回收率均在70%～130%之间，相对标准偏差（RSD）为2.54%～13.18%。

2.6 实际样品分析

采用本研究建立的分析方法对20个市售液体乳样品进行快速筛查与定量，样品主要包含巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳、调制乳。筛查条件约束为质荷比偏差小于5×106、同位素丰度比大于90%、至少一个碎片离子与二级质谱数据库匹配。两个样品中分别有丙溴磷、螺螨酯同时符合上述3个筛查条件，视为阳性检出。利用基质匹配标准曲线进行定量分析，3次平行实验中丙溴磷的检出浓度为3.705、4.144、3.592μg/kg，螺螨酯检出浓度为0.38、0.382、0.416μg/kg。我国国家标准GB 2763-2021规定牛乳中丙溴磷、螺螨酯最大限量值分别为10、4μg/kg，欧盟规定的最大限量值分别为10、4μg/kg，日本规定的最大限量值分别为10、10μg/kg，对比发现均未超标。阳性样品中丙溴磷的色谱和质谱图如图4～6所示。

图1 基制匹配标准工作液中部分农药的提取离子流图

图2 提取溶剂中甲酸含量对目标物回收率的影响

图3 不同净化方式下空白样品的色谱图

图4 阳性样品中丙溴磷色谱图

图5 阳性样品中丙溴磷一级质谱图

图6 阳性样品中丙溴磷二级质谱图

3 结论

本研究建立了液体乳中59种农药残留的高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查与定量分析方法。样品提取液经Captiva EMR-Lipid净化柱一步净化，简化了净化过程，提高了净化效果；在15 min内可实现59种农药残留的色谱分离与质谱定量分析；利用自建农残高分辨数据库，以精确离子质量数、同位素丰度比、二级质谱特征碎片离子为筛查条件完成了快速筛查。在后续研究中还需要进一步扩展农药高分辨质谱信息库，将更多的农药纳入筛查范围，尤其是极性较强、需使用特殊前处理方法和色谱条件的农药分子，如矮壮素、敌草快、百草枯等。