黄芩查尔酮异构酶基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析

薛永常，麻新妍

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁，大连 116034）

黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）是唇形科多年生药用植物，其药用组分为黄酮。查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）是黄酮类化合物合成途径的关键调控酶［1］，可催化查尔酮为柚皮素，控制着其下游黄酮及异黄酮等次生代谢产物的产量［2］，对查尔酮异构酶的研究具有重要意义。研究表明chi超量表达可以提高甘草发根黄酮化合物的含量［3］及红掌花青素的合成［4］；chi下降调节可降低冬枣花色苷和槲皮素含量，延缓冬枣变红［5］。而CHI 既可提高啤酒花中黄腐醇和脱甲基黄腐醇活性，从而影响啤酒风味和品质［6］，又能增加银杏双黄酮的生成，抑制乳腺癌细胞体外增殖，已成为乳腺癌治疗的一种新手段［7］；同时CHI 还能促进酰化黄酮醇苷前体杨梅素生物合成，使酰化黄酮醇苷大增［8-9］，成为治疗II型糖尿病的潜在新药。在传统中药中黄芩多以根部入药，无序采集严重破坏了野生黄芩的生境，因此保护黄芩自然资源，探究黄芩整株植物不同器官在中草药的利用十分必要。Park 等［10］及郭双双等［11］分别从黄芩毛状根及愈伤组织中克隆chi，证明超表达chi可提高黄芩毛状根黄酮化合物的含量。本研究拟从黄芩叶mRNA中反转录获得chi全长cDNA，对其进行生物信息学分析，为野生黄芩资源的可持续利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）采自河北省承德市雾灵山国家自然保护区。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α及BL21（DE3），由本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器

TransZol UP 试剂盒（北京全式金生物有限公司）、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2、pMDTM19-T Vector cloning kit、QuickCutTMEcoRI、Quick-CutTMHindIII、Taq DNA polymerase（5 U/μL）、DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司）、Fast Pure 质粒提取试剂盒（南京诺维赞生物科技有限公司）；

Thermal Cycle Dice TP610（日本TaKaRa 公司）、Himac CR-21G高速冷冻离心机（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计

参考NCBI 数据库中登录号为HQ153041.1、KT963462.1、KP064512.1 的黄芩查尔酮异构酶基因mRNA 序列，通过比对，利用Primer Premier 5.0 设计用于扩增chi全长cDNA的特异性引物：

M-CHI-S：ATGTCTGCTTCGCCATCCG

M-CHI-A：TTAAAACAACTCCGATAGTCTT GCC

1.3.2 黄芩chi基因克隆、质粒转化及鉴定

选取盛花期黄芩叶片，TransZol UP 法提取其总RNA，使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，以M-CHI-S 和M-CHI-A 为特异引物扩增chicDNA。目的扩增产物与pMDTM19-T 连接，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞。重组质粒经鉴定后进行测序，NCBI在线分析目的基因序列。

1.3.3chi基因的原核表达

EcoRI 及HindIII 对pET-32a（+）及pMDTM19-Tchi双酶切，回收目的DNA 片段并连接，构建其表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。

加入适当浓度的IPTG 于pET-32a（+）-chi培养液，以诱导目的蛋白表达。培养液在4℃，13 000 g离心10 min，2 × SDS 上样缓冲液悬浮沉淀；煮沸5 min 后置冰上3 min；13 000 g 离心1 min，取10 μL上清液进行SDS-PAGE［12］。

2 结果与分析

2.1 目的基因chi的反转录扩增

以黄芩叶总RNA 为模板进行chi的RT-PCR。电泳图谱显示在500～750 bp 呈现一条清晰扩增条带，与预期的chi基本一致（如图1）。

图1 chi基因扩增产物凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of chi gene fragment

2.2 目的基因的鉴定

2.2.1 重组质粒的提取及鉴定

挑选白色阳性单克隆菌落提取质粒DNA，电泳图谱呈现一条约3 kb 的清晰的条带，与目的质粒大小基本一致（图2）。

图2 重组质粒DNA电泳图Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid DNA

对质粒DNA 进行特异引物PCR，能够从重组质粒中扩增出一条约700 bp 清晰条带（图3），与chi大小基本一致，质粒构建正确。

图3 质粒DNA中扩增chi基因电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of chi gene from recombinant plasmid DNA

对重组质粒双酶切结果显示，在约2 800 bp 和700 bp 各出现一条清晰的条带，与pMDTM19-T 载体及扩增片段一致（图4），说明重组质粒构建正确。

图4 重组质粒双酶切电泳图Fig.4 Recombinant plasmid cut by two endonucleases

2.2 目的基因序列的生物信息学分析

测序结果表明扩增的目的基因片段全长648 bp，为一个起始密码子为ATG、终止密码子为TAA的完整ORF。同源性分析表明，其与S. baicalensischalcone isomerase（ID：HQ153041.1）相 似 度 达 到100%，拟编码215 个氨基酸，理论分子量为36.854 KDa。EXPASY protparam 预测其等电点为5.09，拟翻译蛋白的分子式为C1040H1632N258O321S4，属于稳定性亲水性蛋白。BLAST 比对表明，该蛋白中含有查尔酮酶核心区域及查尔酮异构酶催化特有结构域PLN02559 模块，属于查尔酮_3 超家族（图5），其主要作用是将查尔酮异构化为柚皮素，从而进行花青素等黄酮类化合物的产生。因此，该目的基因序列为chi全长序列，并将该重组质粒命名为pMDTM19-T-chi。

图5 chi基因的结构域分析Fig. 5 The Analysis of chi gene domain

与来源不同科、属的茶花、紫苏、丹参、青枣、藿香、大花美人蕉chi的系统发育树分析（图6）表明，该序列与同为唇形科黄芩、鼠尾草属丹参、紫苏属紫苏亲缘关系最近，同源性分别为100%、99%、95%；但与荆芥属藿香亲缘关系较远，再次是鼠李科枣属青枣、山茶科茶花及美人蕉科的大花美人蕉。说明chi在同科属中是相对保守的，在不同科植物有一定的差异，这与CHI 在黄酮化合物生物合成途径的地位及作用是相一致的。

图6 chi系统发育树构建Fig. 6 The phylogenetic tree of chi gene

同时对数据库中来源黄芩不同组织/器官——毛状根（HQ153041.1）、愈伤组织（KP064512.1）及本文叶片扩增的chi序列比对（图7），发现chi在黄芩毛状根、愈伤组织及叶片中各只有一个核苷酸的差异，序列高度保守，同源性接近100%，说明CHI在黄芩的不同部位及不同器官可能执行同样的功能，在进化中高度保守。

图7 不同黄芩器官chi序列比对图Fig.7 Multiple alignment of chi from different scutellariae organs

而从其拟表达蛋白的三级结构显示，其α螺旋、无规则卷曲及延伸链占比分别为42.33%、26.89%及21.40%，说明该目的蛋白性质稳定（图8），与同源性分析结果一致。

图8 拟表达的CHI蛋白三级结构预测Fig.8 The tertiary structure prediction of pupative CHI

2.3 chi基因的原核表达与SDS-PAGE分析

培养含有pET-32a（+）及pET-32a（+）-chi的单克隆菌落至OD600为0.6。加入终浓度为0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG以诱导目的蛋白的表达。

SDS-PAGE 图谱（图9）显示，pET-32a（+）在整个诱导过程中均无特异蛋白表达。pET-32a（+）-chi菌株在0.5 mmol/L 和1 mmol/L IPTG 诱导10 h 后，均能表达出一30 kDa 的融合蛋白，与同源性分析的大小基本一致。同时从图谱中看出，0.5 mmol/L 和1 mmol/L IPTG 诱导下pET-32a（+）-chi的蛋白表达差异不大，说明0.5 mmol/L IPTG 已足够蛋白表达的诱导。随着诱导时间的延长，其表达量在诱导16 h 时达到峰值。说明chi基因在大肠杆菌BL21（DE3）得以高效表达。

图9 chi基因表达蛋白SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of chi expressed product

3 结果与讨论

本研究从黄芩叶mRNA 中反转录克隆出一个648 bp的全长chi基因序列，生物信息学分析表明其具有查尔酮异构酶催化特有结构域PLN02559，属于查尔酮_3 超家族成员。构建的表达载体pET-32a（+）-chi在IPTG 诱导下在大肠杆菌中异源表达出一分子量约为30.0 kDa 的目的融合蛋白，为进一步研究CHI的生物学功能奠定了基础。

在对苜蓿CHI 的研究发现，在结合不同底物时主要是保守的Thr48 和Tyr106 与2 个水分子及在Asn113 和Thr90 与黄酮的7-羟基之间的两组氢键起催化作用［13-14］，且在相近物种中是高度保守的，并且与湿泥霉菌、真菌及变形杆菌等CHI 的保守序列区（CDD：174782）也存在较大相似度［15-17］，暗示着CHI作为黄酮类物质生物合成途径的一个关键调控点，从细菌到高等植物中普遍存在，它们可能具有非常古老的起源，且进化保守，预示着可能执行着相似的功能［9，18］。而本研究的chi进化显示chi在黄芩不同器官高度保守，与其它相近科属的物种之间也有广泛的同源性，在不同科属植物中的代谢进化中执行了相同/相似的功能，这与郭双双等［11］的结果是一致的。而从黄芩毛状根、愈伤组织及叶片chi几乎完全相同，预示着传统中草药实践中可以通过组织培养毛状根、愈伤组织或叶替代野生黄芩根用药，对于保护野生黄芩资源具有重要的意义。本研究对黄芩chi的研究为进一步研究CHI 的生物学功能，提高黄芩不同器官中黄酮类化合物含量，为野生黄芩资源的可持续综合利用提供理论依据。