“原络通经”针法对SAMP8小鼠病理形态学及NMDAR表达的影响

郭文海,颜敬彧,邢 菁,陈 奥,徐 佳,马伯艳,史珊怡△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以进行性的记忆和认知功能障碍为特征，是最常见的老年期痴呆[1]。根据世界卫生组织的数据统计，AD占所有痴呆类型的60 %～70 %，是痴呆的主要类型[2]。在我国，AD以发病隐袭、病情进展性加重以及有效治疗手段缺乏等特点居于社会疾病之首[3]。目前主流学说认为AD相关的病理生理学改变为突触损伤或突触功能减弱。而谷氨酸作为大脑中主要的兴奋性神经递质之一，其神经传递对于神经细胞可塑性以及学习、记忆具有根本作用。N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是谷氨酸受体的主要亚型，其在中枢神经系统中高度表达，过度活化会导致神经元不可逆的损伤。NMDAR作为导致神经退行性疾病如AD的主要因素之一，已被研究多年。而与其相关的膜定位和区域化信号可能是AD相关病理生理学的关键[4]。现代研究提示NMDAR通道功能的异常变化与在AD患者中观察到的神经毒性和变性相关，最终结果为导致与AD相关的神经退行性变[5-7]。本研究拟观察“原络通经”针法对SAMP8小鼠海马CA-1区病理形态学及NMDAR表达水平变化的影响，初步探讨“原络通经”针法治疗AD的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SAMP8雄性8月龄小鼠30只，SAMR1 小鼠10只，上述40只小鼠体质量约30～35 g，购于北京大学医学部(实验动物科学部)，许可证号：SCXK(京)2016-0010。将实验动物置于清洁级环境下，予自由摄食饮水的喂养方式，保持环境温度20～26 ℃，湿度40 %～70 %。将30只SAMP8雄性8月龄小鼠随机分为SAMP8空白对照组、SAMP8+“原络通经”针法治疗组以及SAMP8+百会穴针刺组，将10只SAMR1小鼠作为SAMR1正常对照组。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 华佗牌针灸针(0.30 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；水迷宫(JLBehv-MWMG,上海玉研科学仪器有限公司)；药品冷藏柜(BYC-310,山东博科生物)；电热恒温鼓风干燥箱(HGZF-101-1,上海跃进医疗器械有限公司)；显微镜(BX43,OLYMPUS)；切片机(2235,Leica)；超高灵敏度化学发光成像系统[Chemi DocTM XRS+,伯乐生命医学产品(上海)有限公司]。

1.2.2 试剂 苏木素染液(19120302,中衫金桥)；伊红染色液(E607321,Sangon Biotech)；超净高级封片胶(YZB,BASO)；Scott蓝化液(G1865,Solarbio)；RIPA细胞裂解液(C1053, 北京普利莱基因技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(CW0014S, 康为世纪)；Marker(#26617,Thermo)；PVDF膜(IPVH00010, Millipore)；封闭专用脱脂奶粉(P1622,北京普利莱基因技术有限公司)；内参一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH (TA-08,中杉金桥, 1/2000);二抗：辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305,中杉金桥,1/2000)。

1.3 实验方法

1.3.1 针刺干预方法 实验动物选穴定位参照《实验针灸学》进行取穴[8]，其中太白穴参照《针灸学》中人体定位并结合小鼠解剖学特征进行取穴，定位于足内侧缘，第1跖趾关节后下方赤白肉际凹陷处。SAMR1正常对照组(SAMR1)：正常饲养，不进行针灸，但要与SAMP8+“原络通经”针法治疗组(SAMP8 Yuanluo Tongjing)和SAMP8+百会穴针刺组(SAMP8 Baihui)进行相同程度的捉抓。SAMP8空白对照组(SAMP8 NC)同上。SAMP8+“原络通经”针法治疗组:针刺丰隆穴、太白穴、关元穴与百会穴,其中丰隆直刺1 mm，太白直刺1 mm，关元向耻骨联合方向呈45 °斜刺1.5 mm，百会向前斜刺2 mm,穴位分别施幅度：90 °～180 °，频率：60～120 r/min，捻转法30 s。SAMP8+百会穴针刺组:针刺百会穴，针刺手法、角度同SAMP8+“原络通经”针法治疗组。SAMP8+“原络通经”针法治疗组和SAMP8+百会穴针刺组两组1次/d，持续30 d，每7 d休息1次。

1.3.2 Morris水迷宫行为学测定 分别于实验前及实验结束后(第30天)对40只小鼠进行为期7 d的Morris水迷宫行为学测定:①适应阶段。水迷宫主要由1个直径0.9 m、高0.5 m的不锈钢圆柱形水池和1个位置可移动的直径9 cm、高28 cm的平台组成。预先在水池里注入清水达30 cm深，使水面髙出平台1 cm，将水温控制在(24±1)℃，并在水中加入黑色墨水。将平台置于圆柱形水池第二象限的中间，整个实验过程平台位置保持不变。摄像头置于水池中央的上方约2 m处，自动采集和图像分析系统自动记录动物的游泳路径和搜索策略，以及逃避潜伏期、游泳距离、平均速度、初始角度与不同象限的停留时间等参数。②定位航行阶段。依次将小鼠从4个象限的入水点处使其头朝向池壁入水，记录其找到平台的时间(定向航行潜伏期)。若小鼠在90 s内尚未找到平台，则将其引至平台，并让小鼠在平台上停留30 s，然后进行下一象限训练。实验一共进行5 d(次)，比较第1～5天小鼠的逃避潜伏期。③空间探索阶段。定位航行实验结束24 h后，撤去平台，在圆柱形水池第二象限将小鼠面向池壁放入水中，比较4组小鼠穿越平台次数及其在目标象限停留时间。小鼠2象限时间、路程占比以及站台范围1时间越长表示小鼠空间记忆能力越好。

1.3.3 新物体识别实验 实验前7 d，实验人员每天定时抚摸小鼠5 min以缓解其紧张状态:①自由探索阶段(T1)：于实验当天，将小鼠单独放入敞开的、底边长33 cm×33 cm 的方形行为箱中，自由探索5 min。阶段结束后将小鼠取出放回饲养笼，清理箱中残留的粪尿并用75 %酒精擦拭。②相同物体阶段(T2)：于T1阶段结束后24 h开始，在行为箱中放入两个完全相同的物体(物体1和1’) ，再次将小鼠放入行为箱中探索5 min。每次实验结束后，清理箱中残留的粪尿并用75 %酒精擦拭。③替换物体阶段(T3)：于T2阶段结束后1 h开始，物体1保持不变，替换物体1’为大小相近的物体2，再次将小鼠放入行为箱中探索5 min。每次实验结束后，清理箱中残留的粪尿并用75 %酒精擦拭。分别记录T2阶段以及T3阶段中小鼠对两个物体的探索时间，其中探索物体1的时间记为F，探索物体1’或2的时间记为N，计算小鼠对物体1’和2的分辨比(Discrimination ratio，DR)，计算公式为DR=N/(N+F)×100 %。将小鼠面向物体，其头部与该物体的间距≤2 cm定义为探索。

1.3.4 海马区病理损伤程度检测 ①取出组织，经流水冲洗数小时后，分别置入70 %、80 %和90 %的各级乙醇溶液中脱水，随后依次放入纯酒精及二甲苯等量混合液15 min、二甲苯Ⅰ15 min以及二甲苯Ⅱ15 min，直至透明为止;②放入二甲苯和石蜡各半的混合液中15 min，再放入石蜡Ⅰ及石蜡Ⅱ透蜡中各50～60 min;③石蜡包埋、切片，将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡、水化;④将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，随后放入盐酸乙醇分化液中分化15 s，后经水洗返蓝15 s。流水冲洗后，应用伊红染色液染色3 min;⑤流水冲洗后，进行脱水、透明和封片，最后镜检。

1.3.5 海马区NMDAR表达水平检测 ①取小鼠海马经液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，将组织匀浆吸入EP管中,经冰上裂解30 min、12 000 rpm离心10 min后，吸取上清以获得总蛋白并测定蛋白浓度;②将蛋白变性，上样,经十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)2 h;③应用300 mA恒流转膜80 min;④将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中漂洗1～2 min，随后用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60 min;⑤一抗溶液孵育，4 ℃下过夜;⑥二抗溶液孵育，室温下2 h;⑦在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“ImageJ”软件分析各抗体条带灰度值。

2 实验结果

2.1 小鼠学习记忆能力变化情况

SAMR1和SAMR8小鼠在Morris水迷宫行为学测定后判断各编号小鼠学习能力，包括定位航行潜伏期、分组后定位穿越平台平均速度,见图1。实验结果显示，与SAMR1正常对照组比较，各SAMP8组小鼠定位航行潜伏期明显延长，定位穿越平台平均速度、2象限时间占比及路程占比、站台范围1时间明显降低(P<0.05)。与SAMP8空白对照组比较，SAMP8+“原络通经”针法治疗组小鼠2象限时间占比及路程占比、站台范围1时间明显增加(P<0.05);SAMP8+百会穴针刺组小鼠2象限时间占比及路程占比明显增加(P<0.05)。且与单独针刺百会穴比较，“原络通经”针法在增加其2象限时间占比及路程占比、站台范围1时间方面效果更显著(P<0.05)。见图1、表1。

表1 各组小鼠学习记忆能力变化情况

2.2 小鼠新物体识别实验的变化情况

实验结果显示，干预后的SAMP8+“原络通经”针法治疗组和SAMP8+百会穴针刺组在新物体探索时间以及分辨比两个方面均优于SAMP8空白对照组(P<0.05)。与SAMP8+百会穴针刺组比较，SAMP8+“原络通经”针法治疗组在提升新物体探索时间以及提高分辨比两个方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠新物体探索时间以及分辨比

2.3 小鼠脑海马组织中 NMDAR 的表达情况

实验结果显示，与SAMP8空白对照组比较,SAMP8+“原络通经”针法治疗组和SAMP8+百会穴针刺组中NMDAR表达水平显著降低。见图2、表3。

表3 各组小鼠脑海马组织中NMDAR的表达情况

2.4 小鼠脑海马组织HE染色

取各组小鼠海马组织进行HE病理染色，SAMP8对照组出现核皱缩，出现空泡。SAMP8+“原络通经”针法治疗组和SAMP8+百会穴针刺组于干预后没有出现严重的病理问题。见图3。

3 讨论

AD是最常见的老年期认知障碍疾病之一，其主要临床表现为认知功能障碍，病程多呈进行性加重。现有研究提示，NMDAR电生理功能异常导致谷氨酸摄取及再循环系统的严重削弱，被认为与AD中观察到的神经毒性和变性密切相关[4]。作为谷氨酸能神经递质系统重要的组成部分，NMDAR在突触功能和可塑性方面发挥了重要作用[9-10]，对AD患者LTP的建立也有重大影响[11]。在AD的病理学机制中，NMDAR受Aβ影响进而导致谷氨酸能神经递质系统调节机制解除，其最终结果是AD患者在认知、学习和记忆等方面出现功能障碍。有多项研究指出，谷氨酸摄取/再循环机制的损害会导致NMDAR供应增强，进而导致AD相关的兴奋性毒性和神经退行性变[12-14]。因此涉及NMDAR的治疗途径可能在AD的防治中发挥重要作用[15]。

AD属于中医学 “呆病” “善忘”等范畴。中医理论认为本病病因病机为肾虚髓亏、痰瘀闭阻脑络以致神志灵机失用，即所谓“脑为元神之府，精髓之海……老人健忘者，脑渐空也”。临床中治法多围绕补肾益髓、活血化痰以及醒脑益智。“原络通经”针法是脑血管病专家孙远征教授在临床实践中总结出的治疗认知功能障碍的有效方法，具有祛瘀通络、补肾填精之功效[16]。原穴是脏腑原气输注、经过和留止于十二经脉四肢部的腧穴；络穴是表里经联系的穴位，通经是指激发疏通十二经经气。“督脉为阳脉之海，总督诸阳经，通于脑”“任脉为阴脉之海”，而头为诸阳之会，故以任督二脉及阳经穴为主交通阴阳，协调十四经。关元为三阴经与任脉之会，配以百会则更添行气通经之效。同时选择太白-丰隆(脾经原穴-胃经络穴)，配合一定的针刺补泻手法，达到补虚泻实的治疗目的，正应“脾主运化，为后天之本”的中医理论。前期多个研究显示原络通经针法单独使用或联合西药、中药对血管性痴呆、轻度认知功能障碍等多种认识功能障碍均有较好疗效[17-19]。

Morris水迷宫比较实验结果显示，与SAMR1正常对照组比较，各SAMP8组小鼠定位航行潜伏期明显延长，定位穿越平台平均速度、2象限时间占比及路程占比、站台范围1时间明显降低，提示模型组小鼠出现学习记忆能力减退的老化性病态特征。而与SAMP8空白对照组比较,SAMP8+“原络通经”针法治疗组2象限时间占比及路程占比、站台范围1时间明显增加，提示在“原络通经”针法干预下，SAMP8小鼠学习认知功能得到明显改善。且与单独针刺百会穴比较，“原络通经”针法在增加其2象限时间占比及路程占比、站台范围1时间方面效果更显著，提示在改善学习记忆能力方面“原络通经”针法优于单独应用百会穴。

新物体识别实验结果显示，干预后的SAMP8+“原络通经”针法治疗组和SAMP8+百会穴针刺组在新物体探索时间以及分辨比两个方面均优于SAMP8空白对照组。与SAMP8+百会穴针刺组比较，SAMP8+“原络通经”针法治疗组在提升新物体探索时间以及提高分辨比两个方面比较差异无统计学意义。新物体识别实验主要用于检查动物对物体的识别记忆能力，其原理是动物依照物体的相关特征以学习、记忆其相关信息，并建立在动物对新物体自行探索的基础上，具体指在对新奇物体接近、探索的时间更多。本实验结果说明在“原络通经”针法和百会穴针刺干预下，SAMP8小鼠对物体的辨识能力有显著提升。

而HE病理染色结果显示，SAMP8空白对照组出现核皱缩及空泡，而SAMP8+“原络通经”针法治疗组和SAMP8+百会穴针刺组在治疗后未出现严重的病理问题，提示“原络通经”针法和百会穴针刺能有效改善SAMP8小鼠海马组织病理形态学损伤。同时，WB检测结果显示 “原络通经”针法和百会穴针刺均能显著降低NMDAR表达水平，提示“原络通经”针法可显著提高突触可塑性从而改善学习认知功能，但两种针刺组在降低NMDAR表达水平方面无显著差异。

综上所述，“原络通经”针法能有效改善SAMP8小鼠的海马组织病理形态学改变及海马组织神经元损伤，改善其学习记忆能力，以起到防治AD的作用，机制可能是降低NMDAR蛋白的表达水平、抑制其过度活化，并改善其通道功能的异常变化。