大葱小孢子发育时期细胞学与形态特征观察

贾俊香，李娜，杨国栋，田云，蒋欣陶，崔连伟

（辽宁省农业科学院蔬菜研究所，辽宁沈阳 110161）

大葱（Allium fistulosum L）为葱属植物（染色体数2n=2x=16），是重要的蔬菜作物[1]。大葱新品种选育仍以常规育种为主，对于二年生的蔬菜作物大葱而言，常规育种所花费的时间更长，要想获得纯合的自交系通常需要6~8年，甚至更长时间，费工费时。大葱属于常异花授粉植物，花由花梗、花被、子房、花柱、雄蕊、雌蕊组成，伞形花序藏于总苞。但不是所有时期的小孢子都能用于培养，选择适宜时期的花蕾是小孢子培养能否成功的关键因素之一。单倍体育种技术可以在短时间内获得纯合的自交系，提高选育效率，缩短育种年限。前人在番茄[2]、辣椒[3]、黄瓜[4]、西葫芦[5]、大白菜[6]、青花菜[7]、萝卜[8]、甘蓝[9-10]等多种植物上的研究表明，利用单核靠边期的小孢子较易诱导出胚状体，且仅需通过花蕾的外部形态即可判断出花粉的发育时期。刘宁等[11]和胡雪华[12]均开展了大葱花粉母细胞的减数分裂观察，但有关大葱花蕾外部形态与小孢子发育时期中单核靠边期的详细研究较少。该研究对3个不同基因型大葱品种花蕾各发育时期及其与花器官外部形态的相关性进行研究，旨在通过花器官的形态特征来确定小孢子发育时期，从而为进一步开展大葱游离小孢子培养提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地概况。选择在辽宁省农业科学院蔬菜所试验基地温室中进行试验。

1.1.2 供试材料。3个不同基因型的大葱材料，分别为乔香3号、辽葱11号和Ln yc16。乔香3号为独棵香葱品种，株高90 cm，白长40 cm，叶片颜色深绿，抽薹开花晚；辽葱11号为杂交种，株高115 cm，白长55 cm，叶片颜色为绿色，抽薹开花早；而Ln yc16为自交系材料，株高110 cm，白长50 cm，叶片颜色深绿，抽薹开花晚。2020年12月15日，将秋季露地收获的种株栽于试验地，正常田间管理至大葱植株抽薹开花开始采样。

1.2 方法

1.2.1 花蕾的形态观察与测量。大葱现蕾后，在每天8：00—10：00采摘健壮植株上不同大小的花序放入自封袋内带回实验室。用游标卡尺测量花蕾的纵径、横径，并记录花蕾颜色。然后用镊子剥去花被，取出花药，测量花药的纵径和横径，并记录花药颜色。每一时期取花蕾3个，重复3次。

1.2.2 花药的细胞学观察。将各个材料的花蕾按不同大小分类后用卡诺氏固定液（无水乙醇∶冰醋酸=3 V∶1 V）于室温下固定24 h后，取小花，在盐酸∶乙醇＝1 V∶1 V中，60℃恒温下解离8~10 mi n，然后用超纯水冲洗3~5遍，用镊子和解剖针小心去除花梗、花被及子房等较大的组织残渣，将花药放在载玻片上，用改良石碳酸复红染液方法染色，染色1~2 h后，盖上载玻片在L EICA-DM4B显微镜40×10下观察。

每份材料根据不同大小随机取10个花蕾，3次重复，每个花蕾取1个花药，通过视野中小孢子主要发育时期的细胞数与总细胞个数来确定小孢子所处的发育时期，并拍摄照片。

1.2.3 数据处理。数据采用S P SS 16.0软件中D u n c a n方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 大葱花蕾各发育时期的细胞学观察

对基因型不同的大葱花蕾发育过程进行细胞学观察（图1）。大葱花粉母细胞进入分裂之前，在花药压片中可见较多的分裂间期细胞（图1-1），此时两大核仁模糊可见，染色体散于核内，呈颗粒状。

2.1.1 四分体时期。当大葱花粉母细胞核内出现丝状染色体时，即为减数分裂开始，分为2个时期。第1次减数分裂变化复杂，前期Ⅰ可清楚地看到细线期（图1-2）、偶线期（图1-3）、粗线期（图1-4）、双线期（图1-5）和终变期（图1-6），中期Ⅰ时核膜、核仁消失，染色体变得粗短，排列在赤道板上（图1-7）。后期Ⅰ同源染色体分散开并逐渐向两极移动（图1-8，图1-9和图1-10），移向两极时染色体数目减半，直接从2n变为n，n=8。末期Ⅰ核膜、核仁又重新出现，形成2个新的核，2个子核之间出现了1个细胞板（图1-11）。减数分裂Ⅰ期结束后直接进入第2次减数分裂前期Ⅱ，此时分隔壁形成，出现二分体时期（图1-12），染色体相互盘绕于核内。中期Ⅱ2子核内的核膜、核仁消失，染色体变短，分别排列在各自赤道板上。后期Ⅱ2子核内的染色单体离开赤道板移向两极。末期Ⅱ到达两极后开始聚缩，形成4个子核（图1-13、图1-14和图1-15），各子核之间被胼胝质壁分隔。

2.1.2 小孢子的形成。胼胝质不断解体，四分孢子体逐渐彼此分开，小孢子被释放出来，形成各自的细胞壁，小孢子处于单核早期时，内有较厚的细胞质和1个位于中央的细胞核（图1-16、图1-17）。此后，液泡逐渐形成，细胞核被挤压靠近细胞壁，又称为单核靠边期。随着花蕾中小孢子的发育，经过一次有丝分裂之后形成生殖核和营养核各1个。生殖核距离细胞壁近，营养核距离液泡近，此时为双核期（图1-18）。其体积不断增大，形状由球形发展为橄榄型，这时花粉粒膨大，花粉壁也开始增厚，萌发沟部分明显向外凸出，逐渐成长为成熟的花粉粒（图1-19、图1-20）。

图1 大葱小孢子各发育阶段的细胞学特征

2.2 大葱小孢子发育时期与花蕾形态特征的相关性

从表1可以看出，在不同的发育时期，3份试验材料的花蕾纵径和花药纵径均差异显著。辽葱11号和Ln yc16的花药横径差异较大，而乔香3号差异不明显。随着小孢子生长发育，花蕾横径和花蕾纵横比也逐渐增大，花被长度变化幅度较大。

表1 不同大葱材料小孢子各发育时期花器官的形态特征

从表2可以看出，小孢子处于单核靠边期时花蕾的纵径在4.700~6.133mm范围内，花蕾横径在2.200~2.567mm，花蕾纵横比在2.133~2.390，花药纵径在2.0~2.6 mm，花药横径在0.767~0.867 mm，药被比在0.507~0.517。在供试材料中，单核靠边期时，不同基因型材料间的花蕾纵径差异相对较大，而花蕾横径、花药纵径、花药横径和花被长等形态特征的同一尺寸在不同试材中有交叉现象，而且分布在小孢子发育的不同时期，因此，这些性状不能作为衡量小孢子单核靠边期的标准。而花蕾纵横比和药被比的适宜大小不存在与其他发育时期尺寸相同的现象，它们更适宜作为不同材料取样适期的通用尺寸，花蕾纵横比在2.133~2.390，药被比在0.507~0.517，此范围可作为大葱不同材料花蕾单核靠边期的鉴定标准。

表2 不同大葱材料小孢子单核靠边期花器官的形态特征

供试材料的大葱小孢子发育时期花器官的其他外部形态特征，不同基因型大葱小孢子各发育时期花蕾的形态差异明显，处于单核靠边期时，其花蕾明显变大，花药被花被包裹，前者长度比后者长度的1/2还长一些，花被浅绿色，花药黄绿色（表3）。

表3 大葱小孢子不同发育时期花器官的其他外部形态特征

3 结论与讨论

该文利用改良石碳酸复红染液方法对不同时期的大葱花蕾进行染色、压片观察，染色效果非常好，能清楚地观察到染色体和细胞核的分布情况，成本低，操作简单。在小孢子培养中，并不是任何时期的小孢子均可以培养，十字花科中的多个作物已经找到小孢子培养的最佳时期，如羽衣甘蓝[13]、芥蓝[14]、白菜[15]、甜瓜[16]、红菜薹[17]和小白菜[18]等作物，多以单核靠边期至双核初期时小孢子诱导胚状体发生最佳，即花瓣与花药比为0.50~0.60时小孢子出胚率最高。此时期小孢子容易诱导成胚。茄子花蕾处于单核中晚期，长度在10.0~11.1 mm时[19]，小孢子培养效果最佳。

大葱是伞形花序，上部花先开，中部次之，下部最晚，因此，在取花药压片时要注意花序中花蕾的部位和花蕾大小。研究发现1.5 mm以下的花蕾多以无分裂现象出现；1.5~2.3 mm的花蕾，第1次减数分裂前期多；2.4~2.7 mm的花蕾，以第2次减数分裂前期多，出现明显的二分体时期；2.7~4.6 mm之间的花蕾，不同时期分裂现象并存：其中，2.8~3.3 mm的花蕾时多为第2次减数分裂末期四分孢子体时期，3.4~4.6 mm，多为单核早期；4.700~6.133 mm时出现多为单核靠边孢子体时期；6.467~6.867 mm为双核期；药被比在0.507~0.517时可取样进行单倍体培养。不同类型材料花蕾大小会有些差异，在进行小孢子培养时，有必要了解供试材料花器官的适宜培养时期与外部形态的相关性，可综合花蕾大小、花蕾纵横比、药被比和花药的形状、大小和颜色等因素来判断其发育时期，无需镜检、省时省力。此外，还要考虑供试材料的基因型、培养基成分、小孢子浓度、热激温度和时间等因素，有利于提高小孢子培养效率。