外周血CCL26、CCR3表达与变应性鼻炎患者疾病严重程度的关系

熊洪斌，杨茜，石润杰

1.上海市奉贤区奉城医院耳鼻喉科，上海 201411；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻喉科，上海 200011

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又被称为变态反应性鼻炎或过敏性鼻炎，是指患者接触到的过敏物质与机体免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)抗体结合发生桥联反应作用于鼻黏膜从而引起患者发生血管通透性增加、毛细血管扩张等过敏反应[1-2]。AR主要临床症状为连续性或间歇性打喷嚏、流清水鼻涕、鼻塞、嗅觉暂时性减退等，虽然不会危及患者的生命安全，但严重影响患者的生活质量。目前，关于AR的诊断主要依赖于临床症状评分，但可能存在患者过度描述临床症状，无法准确判断AR，因此，寻找与AR有关的生物标志物成为目前研究的热点[3-4]。趋化因子配体26(chemokine C-C motif ligand 26，CCL26)又叫嗜酸性粒细胞趋化因子3(eosinophil chemotactic factor-3，eotaxin-3)，属于CC家族重要成员之一。有研究表明，CCL26在炎症反应、过敏反应等发挥重要作用[5]，其与CC趋化因子受体-3(C-C chemokine receptor-3，CCR3)结合后，特异性激活嗜酸性粒细胞向炎症趋化，释放组织胺等炎性介质从而参与炎症反应和过敏性反应。CCR3是一种非特异性受体蛋白，除了作为CCL26的受体发挥作用之外，也可作为嗜酸性粒细胞趋化因子1(eosinophil chemotactic factor-1，eotaxin-1)、嗜酸性粒细胞趋化因子2(eosinophil chemotactic factor-2，eotaxin-2)等其他CC趋化因子的受体来发挥不同生物学功能[6]。本研究通过检测AR患者CCL26、CCR3表达水平，探讨其与AR疾病严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年1月在上海市奉贤区奉城医院耳鼻喉科收治的86例AR患者作为研究对象(研究组)。纳入标准：①符合《AR诊断和治疗指南》中关于AR的诊断标准[7]；②入院前未接受抗组胺、免疫等治疗；③知情同意并签署同意书；④临床资料完整。排除标准：①伴有肝脏、肺肾等重要器官疾病；②合并鼻窦炎、哮喘等过敏性疾病；③合并自身免疫性疾病；④合并精神疾病。86例患者中男性45例，女性41例；年龄24～57岁，平均(34.49±4.71)岁。根据《变应性鼻炎及其对哮喘的影响》中的分类标准[8]将所有AR患者分为轻度AR组(30例)、中度AR组(27例)和重度AR组(29例)。另选取同时期在我院保健科体检的91例健康志愿者作为对照组，其中男性46例，女性45例；年龄22～53岁，平均(35.91±4.66)岁。评价所有受试者的过敏性鼻炎评分量表(Score for Allergic Rhinitis，SFAR)评分。研究组和对照组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。本研究经上海市奉贤区奉城医院医学伦理委员会批准。

1.2 检测方法

1.2.1 样本采集 采集所有受试者空腹静脉血4 mL，以3 000 r/min离心15 min后分离血清，并置于-80℃环境中保存待测。清晨空腹肘静脉血置于乙二胺四乙酸抗凝管中，2 000 r/min离心15 min分离出血浆。

1.2.2 检测外周血CCL26、CCR3表达水平 采用ELISA法测定各组受试者外周血CCL26的表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，CCL26试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司。采用流式细胞分析仪检测外周血CCR3相对表达量，首先加入CCR3-FITC(10 mL)试剂至指标试管中，随后将血浆100 mL加入至试验检测试管中，设有同型号对照试管，摇匀后，25℃避光孵育20 min，随后加入溶血素2 mL，25℃避光放置5 min，离心后(1 000 r/min离心5 min)丢掉上清液，加磷酸盐缓冲溶液(PBS)2 mL，再一次离心丢掉上清液，添加300 mL PBS溶液，摇匀，采用流式细胞仪(型号：BD FACSCalibur)上机检测分析外周血CCR3在血浆中的表达。流式细胞分析仪(型号：BD FACSCalibur)购自美国BD公司。

1.3 观察指标 比较两组受试者外周血CCL26、CCR3表达水平、不同临床参数AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平以及不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平；分析AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平与SFAR评分的相关性；分析CCL26、CCR3对AR的诊断价值；分析影响AR的危险因素。

1.4 统计学方法 应用SPSS25.0统计软件分析数据。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平与SFAR评分的相关性采用Pearson相关分析法分析；CCL26、CCR3对AR的诊断价值采用受试者工作特征曲线(ROC)曲线分析；影响AR发生的危险因素采用多因素Logistic回归分析。检验水准取α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者的外周血的CCL26、CCR3表达水平比较 与对照组比较，研究组患者外周血CCL26、CCR3表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组受试者的外周血CCL26、CCR3表达水平比较(±s)

表1 两组受试者的外周血CCL26、CCR3表达水平比较(±s)

组别对照组研究组t值P值例数91 86 CCL26(ng/L)2.44±0.39 4.83±1.07 19.954 0.001 CCR3(%)20.41±5.39 40.63±9.25 17.887 0.001

2.2 不同临床参数AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较 不同性别、年龄、变应原、症状发作时间的AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；IgE阳性者外周血CCL26、CCR3表达水平明显低于IgE阴性者，SFAR＜7者外周血CCL26、CCR3表达水平明显低于SFAR≥7者，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 不同临床参数AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较(n=86,±s)

表2 不同临床参数AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较(n=86,±s)

项目性别(例)男女年龄(岁)＜36≥36变应原季节性常年性有无症状发作时间间接性持续性IgE阳性阴性SFAR＜7≥7例数45 41 40 46 51 35 48 38 33 53 55 31 30 56 CCL26(ng/L)3.12±0.99 3.25±1.01 3.33±1.05 3.32±1.02 3.11±0.89 3.51±1.25 4.19±1.86 3.41±1.30 4.02±1.56 4.21±1.64 4.96±1.42 3.87±1.49 3.16±0.87 4.13±1.55 t值0.602 0.045 0.946 1.734 0.087 0.532 0.596 3.358 0.001 3.165 0.002 P值0.549 CCR3(%)41.52±8.31 40.91±9.04 39.69±8.07 40.12±8.81 40.32±8.97 41.01±9.11 41.98±9.64 33.21±8.99 42.35±8.91 42.12±8.77 50.94±9.98 42.56±9.74 35.44±8.78 49.96±9.67 t值0.326 0.235 0.815 0.348 0.729 0.118 0.907 3.771 0.001 6.847 0.001 P值0.745

2.3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较 与轻度AR组比较，中度AR组、重度AR组患者外周血CCL26、CCR3表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，与中度AR组比较，重度AR组患者外周血CCL26、CCR3表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较(±s)

表3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平比较(±s)

注：与轻度AR组比较，a P＜0.05；与中度AR组比较，b P＜0.05。

组别轻度AR组中度AR组重度AR组F值P值例数30 27 29 CCL26(ng/L)3.86±0.97 4.99±1.02a 5.69±1.23ab 21.616 0.001 CCR3(%)35.44±8.66 40.21±9.45a 46.38±9.68ab 10.326 0.001

2.4 AR患者外周血CCL26、CCR3表达水平与SFAR评分的相关性 经Pearson相关分析法分析结果显示，CCL26、CCR3表达水平与SFAR评分均呈正相关(r=0.657、0.686，P＜0.01)，见图1。

图1 CCL26、CCR3与SFAR评分的相关性

2.5 CCL26、CCR3对AR发生的诊断价值 ROC曲线结果显示，外周血CCL26诊断AR发生的ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.697(0.618～0.777)，敏感度为51.2%，特异性为87.9%，截断值为2.914 ng/L；CCR3诊断AR发生的AUC为0.752(0.678～0.827)，敏感度为62.8%，特异性为84.6%，截断值为31.197；两者联合检测的AUC为0.833(0.769～0.897)，敏感度为73.3%，特异性为86.8%，见图2。

图2 ROC曲线

2.6 影响AR发生的危险因素 将是否患有AR作为因变量(未发生为0，发生为1)，以CCL26水平、CCR3表达水平作为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，外周血CCL26、CCR3表达水平是影响AR发生的独立危险因素(P＜0.05)，见表4。

表4 影响AR发生的多因素Logistic回归分析

3 讨论

AR是耳鼻咽喉头颈外科常见的非感染性炎性疾病之一。AR严重影响患者的正常生活和工作。世界上约有5亿人罹患AR，占全人类的10%～20%[9]。有研究表明，我国19个一线城市的AR发病率为4%～38%，且呈上升趋势[10]。目前AR的诊断主要依赖临床症状评分，然而该方法存在主观性，AR病情无法得以准确判断，因此寻找客观有效的生物学指标以评估AR病情成为当前研究的热点[11-12]。

CCL26由77个氨基酸组成，能使炎症细胞聚集，造成炎症反应和过敏性反应。其主要通过与CCR3结合而发挥作用，两者存在一定的协同作用。CCL26水平升高说明机体发生炎症反应。研究表明，CCL26与迟发型变态反应有关，且可作为评估急、慢性炎症严重程度的生物学指标[13]。刘钰等[14]研究结果表明，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血清CCL26水平远高于正常人，其表达水平随ARDS病情的加重而升高，且ARDS死亡患者血清CCL26水平明显高于存活患者。肖雷等[15]研究结果表明，支气管哮喘急性期患儿血清CCL26水平明显高于哮喘缓解期患儿，且其水平随哮喘病情的加重而升高。本研究中，与对照组比较，研究组AR患者外周血CCL26水平明显升高，随AR病情的加重而升高。且Pearson相关分析法分析显示AR患者外周血CCL26水平与SFAR评分呈正相关，与前述研究结果相近，提示CCL26的表达在AR的发生发展中起到一定作用，且CCL26可反映AR病情严重程度。此外，本研究中多因素Logistic回归分析表明，CCL26是AR发生的独立危险因素，提示CCL26可作为诊断AR发生的辅助指标。

CCR3是一种含7次跨膜结构的G蛋白耦联非特异性受体，是CC型趋化因子的唯一受体。eotaxin-1、eotaxin-2、CCL26、单核细胞趋化因子、CCL5等均通过与CCR3结合后发挥作用。研究表明，eotaxins几乎都是通过CCR3介导而发挥对嗜酸性粒细胞的趋化作用，且CCR3还能够激活Th2细胞亚群，使其大量释放炎性因子从而发生炎症反应[16]。杨艳等[17]研究结果表明，慢性自发性荨麻疹患者CCR3表达水平明显高于健康者。DE CAMPOS等[18]研究显示持续性变应性鼻炎患者鼻黏膜中CCR3表达水平上调。本研究结果显示，与对照组比较，研究组AR患者外周血CCR3表达水平明显升高，其水平随AR病情的加重而升高。经Pearson相关分析法分析结果显示AR患者外周血CCR3表达水平与SFAR评分呈正相关，与前述研究结果相近，提示CCR3表达水平与AR发生发展有关。CCR3可反映AR病情严重程度，推测可能是CCR3介导嗜酸性粒细胞聚集，而后激活的嗜酸性粒细胞通过释放炎性介质参与炎症性疾病的发生。多因素Logistic回归分析表明，CCL26是AR发生的独立危险因素，提示CCR3可辅助诊断AR的发生。

此外，经ROC曲线分析结果显示，CCL26诊断AR患者的AUC为0.697，取最佳诊断界值2.914 ng/L时，相应的敏感度为51.2%，特异性为87.9%；CCR3诊断AR患者的AUC为0.752，取最佳诊断界值31.197时，相应的敏感度为62.8%，特异性为84.6%；两者联合检测的AUC为0.833，敏感度为73.3%，特异性为86.8%。这说明CCL26、CCR3表达水平检测对AR的诊断具有一定价值，但两种方法联合检测优于单独一种方法检测。

综上所述，CCL26、CCR3的表达水平与AR的发生有关，且其可判断AR病情的严重程度，并为AR患者的诊断提供理论依据。