Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59抑制子宫内膜异位症子宫内膜干细胞的增殖

耿杨柳， 冉鹏宁， 徐 香

(国药东风总医院妇产科，湖北省十堰市 442000)

子宫内膜异位症(endometriosis,EM)是育龄期妇女的常见病和多发病，临床表现为不孕、盆腔痛及痛经等，EM的发病机制尚不明确，临床治疗手段有限，且具有较高的复发率和恶变率[1]。子宫内膜干细胞能够随血液逆流进入盆腔并在异位种植形成病灶，提示子宫内膜干细胞可能与EM的发病过程有关[2]。Wnt/β-catenin通路是常见的调控基因转录、细胞增殖的信号通路，参与了多种子宫内膜疾病的病理过程[3]。本研究分析Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59对EM子宫内膜干细胞增殖的作用，为相关临床治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

子宫内膜组织来自于本院2017年7月—2018年7月因子宫肌瘤或者EM子宫切除患者，子宫内膜干细胞参考文献[4]由本实验室分离纯化获得。Wnt3a一抗(武汉艾美捷科技有限公司)；β-catenin一抗(北京百奥莱博科技有限公司)；Caspase-3一抗(R&D公司)；Caspase-9一抗(武汉博士德生物工程有限公司)；二抗及显色试剂盒(Santa Cruz公司)；无菌磷酸盐缓冲液(碧云天生物技术有限公司)；胶原酶(Sigma Aldrich公司)；脱色摇床及转膜仪(北京六一仪器厂)；垂直电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio Rad公司)；离心机(美国贝克曼库尔特公司)。其余试剂均为市售分析纯。LC3检测试剂盒(R&D公司)；Beclin1检测试剂盒(Abcam公司)；多功能酶标仪(Infinite M200，瑞士)。

1.2 MTT法

将子宫内膜干细胞接种至48孔细胞培养板，培养至生长状态良好后，随机分为对照组(n=5)、低剂量组(5 mmol/L Wnt-C59，n=5)和高剂量组(30 mmol/L Wnt-C59，n=5)，每个样品设置3个平行样品。对照组给予生理盐水处理4 h，其余各组给予对应剂量Wnt-C59处理4 h。每孔加入20 mL MTT溶液后继续培养，每个样品的3个平行样品分别于1、2、4 h后终止培养，弃培养上清液，采用无菌磷酸盐缓冲液冲洗后加入150 mL二甲基亚砜，振荡处理10 min。用酶标仪检测培养后各培养孔的光密度值，并计算抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD490-试验组OD490)/对照组OD490×100%。

1.3 Western blotting

各组细胞进行相应的处理后，提取细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法进行定量。以等量总蛋白与5×SDS上样缓冲液煮沸10 min后进行垂直SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行半干法转膜(320 mA/80 min)将蛋白质转移至硝酸纤维素薄膜上。转膜后用5.0%脱脂牛奶封闭1 h，无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次。将封闭后的纤维素薄膜与一抗(1∶200)在4 ℃条件下孵育4 h，无菌PBS漂洗后加入二抗(1∶4 000)孵育2 h后进行显色。以β-actin为内参进行Wnt3a、β-catenin、Caspase-3和Caspase-9蛋白水平的相对定量分析。

1.4 酶联免疫吸附测定法

吸取培养板中培养基，加入胶原酶，吹打后室温放置5 min充分裂解。将悬液收集至离心管中，1 500 r/min离心10 min后加入无菌磷酸盐缓冲液重悬细胞，-80 ℃和室温反复冻融数次后待测。采用包被稀释液稀释样品，5.0%脱脂牛奶封闭酶标仪反应孔1 h，吸取100 mL样本于酶标仪反应孔中，加入酶标抗体后充分反应45 min，加入底物液室温避光放置5 min后加入终止液终止反应，检测OD450处光密度值。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 Wnt-C59对子宫内膜干细胞增殖的影响

Wnt-C59处理1、2和4 h后，子宫内膜干细胞增殖受到明显抑制，且高剂量组抑制效果明显高于低剂量组(P<0.05；表1)。

表1 Wnt-C59对子宫内膜干细胞增殖抑制率的影响 单位：%

2.2 Wnt-C59对Wnt3a及β-catenin蛋白水平的影响

Wnt-C59处理后，子宫内膜干细胞Wnt3a及β-catenin蛋白水平较对照组明显降低(P<0.05)，高剂量组较低剂量组更为显著(P<0.05；图1)。

图1 Wnt-C59对Wnt3a及β-catenin蛋白相对表达水平的影响

2.3 Wnt3a及β-catenin蛋白与子宫内膜干细胞增殖抑制率的相关性

Wnt-C59处理后，子宫内膜干细胞Wnt3a及β-catenin蛋白水平均与Wnt-C59处理4 h后子宫内膜干细胞增殖的抑制率呈明显负相关(P<0.05；图2)。

图2 Wnt3a及β-catenin蛋白与子宫内膜干细胞增殖抑制率的相关性

2.4 Wnt-C59对子宫内膜干细胞凋亡蛋白水平的影响

Wnt-C59处理后，子宫内膜干细胞凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的水平较对照组升高(P<0.05)，高剂量组较低剂量组差异有显著性(P<0.05；图3)。

图3 Wnt-C59对子宫内膜干细胞Caspase-3及Caspase-9蛋白水平的影响

2.5 Wnt-C59对子宫内膜干细胞自噬相关蛋白水平的影响

Wnt-C59处理后，子宫内膜干细胞LC3、Beclin1蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05)，高剂量组较低剂量组更为显著(P<0.05；表2)。

表2 Wnt-C59对子宫内膜干细胞自噬相关蛋白水平的影响 单位：μg/L

3 讨 论

EM指具有增殖活性的子宫内膜细胞种植在子宫内膜之外的位置，形成异位子宫内膜组织的增生性疾病。子宫内膜干细胞学说是近年来出现的解释EM发病机理的学说，该学说认为子宫内膜的高度再生能力与成体干细胞密切相关，子宫内膜干细胞作为一种成体干细胞，具有无限增殖潜能、自我更新和分化能力，可引发EM、子宫内膜增生及子宫内膜癌等一系列子宫内膜增生性病变[5-6]。其中，EM的发病是由于子宫内膜干细胞沿着血液逆流进入盆腔内并进行增殖、分化。Wnt/β-catenin信号通路常见于各种细胞中，与细胞的增殖、分化作用密切相关[7-8]。本研究采用Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59处理体外培养的子宫内膜干细胞，分析处理后子宫内膜干细胞增殖作用与Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt3a及β-catenin水平的相关性，及对子宫内膜干细胞凋亡作用及自噬作用的影响。

Wnt/β-catenin通路是一种调控细胞内基因转录、细胞增殖的信号通路，Wnt与β-catenin是Wnt/β-catenin通路分子作用机制中重要的蛋白。Wnt可通过与子宫内膜干细胞表面特异性受体结合，抑制胞质内蛋白酶对β-catenin的磷酸化修饰、泛素化修饰及降解作用，促使β-catenin在胞质内聚集，并进入到细胞核中与转录子发生相互作用，促进下游基因转录[9]。本研究结果显示，经Wnt-C59处理后子宫内膜干细胞的增殖受到明显抑制，高剂量组的抑制效果明显高于低剂量组；子宫内膜干细胞Wnt3a及β-catenin蛋白的表达明显降低，高剂量组降低比低剂量组更显著。本研究Pearson相关性分析结果显示，子宫内膜干细胞的增殖抑制率与Wnt3a及β-catenin水平均呈现较强的负相关，表明Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59能有效抑制EM子宫内膜干细胞增殖及Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt3a及β-catenin的水平，且Wnt-C59对EM子宫内膜干细胞增殖的抑制作用可能与其对Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平的抑制有关。分析其原因在于，Wnt-C59可通过抑制Porcupine酶活性，从而抑制Porcupine酶介导的Wnt蛋白棕榈酰化修饰过程，减少Wnt蛋白的合成分泌，进而使得Wnt蛋白对子宫内膜干细胞胞内蛋白磷酸化酶、泛素化酶的调控作用减弱，β-catenin蛋白在胞质内泛酸化酶等的作用下泛素化并降解，β-catenin蛋白水平下降，对基因转录的促进作用减弱，从而起到抑制Wnt/β-catenin信号通路调控细胞增殖的作用[10]。

细胞的凋亡作用、自噬作用与增生性病变的发病、病情进展密切相关。研究表明，细胞的凋亡作用和自噬作用在细胞增殖、细胞修复及机体对增生病变细胞的清除中发挥着重要作用[11-12]。本研究进一步研究了Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59对子宫内膜干细胞中细胞凋亡蛋白、自噬相关蛋白水平的影响，结果显示，经Wnt-C59处理后子宫内膜干细胞中Caspase-3、Caspase-9的水平明显升高，高剂量组显著高于低剂量组。而经Wnt-C59处理后子宫内膜干细胞中LC3、Beclin1水平明显升高，高剂量组显著高于低剂量组。其中Caspase-3、Caspase-9均是直接参与细胞凋亡作用的蛋白，Beclin1是细胞自噬的关键调控蛋白，LC3是伴随自噬作用产生的自噬标志物[13-14]。Wnt-C59可促进子宫内膜干细胞的凋亡及自噬，分析其原因在于，一方面Wnt-C59通过降低胞内β-catenin水平，可能降低了凋亡抑制因子Survivin的表达，下调了对细胞凋亡的抑制，进而起到对细胞凋亡的促进作用；另一方面Wnt/β-catenin通路与调控细胞自噬的TSC/mTOR信号通路密切相关，Wnt-C59可通过下调Wnt水平，抑制TSC相关复合物的形成，增加mTOR的降解，从而下调对细胞自噬的抑制作用，起到促进细胞自噬的作用[15-16]。

综上所述，Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59能有效抑制EM子宫内膜干细胞增殖，促进EM子宫内膜干细胞的凋亡、自噬作用，其作用可能与其对Wnt/β-catenin信号通路的抑制有关。