温度对不同地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育的影响

毕 萌，宫相忠，庄英瑞，张 敏，刘德举，沈世军

(中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003)

引 言

萱藻(Scytosiphonlomentaria)，隶属褐藻门(Phaeophyta)、萱藻科(Scytosiphonaceae)、萱藻属(Scytosiphon)，为一年生广温性海藻，具有异形世代交替的生活史，分布于我国辽东半岛至广东省海陵岛之间的沿海海域，此外，在俄罗斯的勘察加群岛，日本的北海道岛，丹麦的格陵兰岛，澳大利亚的塔斯马尼亚岛，智利的乔诺斯群岛等沿岸海域也有分布[1-3]。萱藻富含蛋白质、脂肪、多糖及不溶性膳食纤维等营养成分，其中，粗蛋白含量为19.7%，约是海带粗蛋白含量的两倍[4-5]。因此，萱藻是一种优质的蛋白源，具有极高的营养价值。此外，萱藻活性物质还有抗病毒[6]、抗肿瘤[7-11]、抗氧化[12]、抗凝血[13-14]等功效，其中岩藻多糖是一种天然的肿瘤抑制剂，可显著抑制肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞等多种癌细胞的活性[7-11]，萱藻多酚可用作天然的抗氧化剂，清除自由基[12]。因此，萱藻是一种极具开发潜力的新型经济海藻。

自上世纪50年代以来，我国海藻栽培业发展迅速，目前已实现了海带(Laminariajaponica)、条斑紫菜(Pyropiayezoensis)、裙带菜(Undariapinnatifida)等十余种经济海藻的苗种繁育与人工养殖，并在辽宁、山东、江苏、浙江、福建、广东、海南沿海形成了大规模的海藻养殖产业带。我国条斑紫菜的人工养殖最早开展于山东青岛、辽宁大连等北方沿海地区。随后，根据条斑紫菜壳孢子放散、附着、萌发对温度的适应性，通过延迟采苗和育苗时间，成功在江苏南通、浙江温州等南方沿海地区实现了规模化养殖[15-16]。20世纪70年代，我国裙带菜苗种繁育与养殖技术发展迅速，率先在山东、辽宁的沿海地区实现了大规模人工养殖。为进一步扩大裙带菜的养殖规模，根据南方地理种群裙带菜幼孢子体对温度的适应性，控制育苗温度为18～22 ℃，成功在南方沿海地区实现了人工养殖[17-18]。与传统经济海藻相比，萱藻的人工养殖起步较晚[19-24]，目前仅在山东、辽宁的部分沿海地区实现了萱藻苗种繁育和小规模栽培。因此，为进一步扩大萱藻养殖范围，有必要在南方沿海地区开展萱藻苗种繁育与人工养殖。本研究通过比较中国南北方不同地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育对温度的生态适应性，将为南方沿海地区萱藻的苗种繁育与养殖提供基础数据，并为南北方萱藻苗种的异地繁育与养殖提供技术指导，从而最大限度地拓宽适宜萱藻采苗和育苗的时间范围，提高苗种产量。

孢子的附着、萌发是育苗的关键环节，直接影响萱藻苗种的产量和质量。北方地理种群萱藻孢子在12～20 ℃的天然海水中均可附着、萌发[23]，因此，在育苗过程中，适当调节温度，可提高萱藻孢子的附着率、萌发率，从而提高萱藻的出苗率。夏云捷[24]通过比较温度对中国南北方不同地理种群萱藻丝状体生长的影响发现，南方萱藻丝状体生长的最适温度为22.5 ℃，北方萱藻丝状体生长的最适温度为21 ℃，该结果为南北方不同地理种群萱藻丝状体的高效扩增提供了基础数据。目前，关于环境因子对萱藻孢子附着、萌发影响的研究仅以北方地理种群萱藻为研究材料[22-23]，而南方地理种群萱藻的相关研究及南北方不同地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育的比较研究尚未见报道。因此，本研究以大连、温州野生萱藻种质为材料，比较了温度对中国南北方不同地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育的影响，为进一步扩大萱藻的养殖范围，为建立南方萱藻品种的高温育种技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及预处理

实验所用大连、温州野生萱藻种质取自本实验室种质库。取萱藻丝状体，打碎后放入光照培养箱中充气扩增培养。培养条件为20 ℃，光暗周期L:D=14:10，光照强度(64.0±4.4) μmol /(m2·s)，培养液为F1培养液[21]。收集足量的萱藻丝状体，诱导单室孢子囊的形成[20]。将含有成熟孢子囊的大连、温州萱藻丝状体阴干后，放入灭菌海水中进行孢子放散[20]，2 h后取出丝状体，并用灭菌海水配制成孢子密度均为3.0×104ind/mL的孢子液。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子附着

在直径为9 cm的培养皿中置入8个20 mm×20 mm的盖玻片，各盖玻片不重叠。将孢子密度均为3.0×104ind/mL的大连、温州孢子液加至培养皿中，每皿40 mL。将培养皿分别置于10、12、14、16、18、20 ℃的光照培养箱中进行孢子附着，每个梯度设置3个平行样，其他条件为光照强度(54.0±4.4) μmol /(m2·s)，光暗周期L:D=10:14。48 h后用灭菌海水冲洗去除附着不牢固的孢子，在400×显微镜下随机选取30个视野，统计大连、温州萱藻孢子的附着密度。

1.2.2 孢子萌发

将上述附着48 h的玻片取出，用灭菌海水冲洗去除附着不牢固的孢子，然后放入培养皿中，加入40 mL灭菌海水，使附着的孢子继续在10、12、14、16、18、20 ℃的光照培养箱下萌发，每个梯度设置3个平行样，此时记为实验第1天，其他条件为光照强度(36.0±4.4) μmol /(m2·s)，光暗周期L:D=10:14，每3 d更换一次培养液。实验第9天在400×显微镜下随机选取30个视野，统计大连、温州萱藻孢子萌发的孢子个数，以孢子萌发率为指标衡量孢子的萌发情况，计算公式如下：

孢子萌发率( % ) = 萌发孢子个数/(已萌发孢子个数+未萌发孢子个数)×100%。

1.2.3 幼配子体的早期发育

显微观察上述温度下大连、温州萱藻幼配子体的早期发育情况，通过NOKON 80i显微成像系统获取图片，培养30 d时用IScapture显微成像软件随机测量30株幼配子体的长度，比较研究大连、温州萱藻幼配子体的早期发育情况。

1.3 数据分析

实验结果用SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)、独立样本T检验比较结果差异性，以P<0.05为差异显著，用Sigmaplot 10.0软件制图。

2 结果

2.1 温度对中国南北方不同地理种群萱藻孢子附着的影响

在实验设置的温度梯度下，48 h大连、温州萱藻孢子附着密度随温度升高均呈先增大后减小的趋势(图1)，大连萱藻孢子附着密度在10～16 ℃随温度升高逐渐增大，在16～20 ℃随温度升高逐渐减小，16 ℃下达到最大，48 h时为(1.93±0.35)×104ind/cm2，显著高于其他温度下大连萱藻孢子附着密度(P<0.05)。温州萱藻孢子附着密度在10～18 ℃随温度升高逐渐增大，在18、20 ℃随温度升高逐渐减小，18 ℃下达到最大，48 h时为(2.06±0.09)×104ind/cm2，显著高于其他温度下温州萱藻孢子附着密度(P<0.05)。

图1 温度对大连、温州两个地理种群萱藻孢子附着的影响(附着48 h)

孢子附着后变圆，近似球形，颜色呈浅褐色(图版-1)。连续观察发现，10、12 ℃实验组大连萱藻孢子游动活泼，可保持长时间游动不附着，48 h时在海水中仍有大量尚未附着的孢子，附着密度分别为(0.86±0.03)×104、(0.96±0.03)×104ind/cm2，显著低于其他温度下大连萱藻孢子的附着密度(P<0.05)，14～20 ℃实验组的大连萱藻孢子在0.5 h时开始附着，但20 ℃下附着不牢固，孢子易脱落且附着不均匀。10～14 ℃下温州萱藻孢子游动速度较快，可保持长时间游动不附着，48 h时在海水中仍有大量尚未附着的孢子，孢子附着密度分别为(0.78±0.06)×104、(0.84±0.03)×104、(1.04±0.09)×104ind/cm2，显著低于其他温度下温州萱藻孢子附着密度(P<0.05)。16～20 ℃下温州萱藻孢子在0.5 h开始附着，且孢子附着牢固。综上所述，大连萱藻孢子附着的适宜温度范围为14～18 ℃，最适温度为16 ℃，温州萱藻孢子附着的适宜温度范围为16～20 ℃，最适温度为18 ℃。

2.2 温度对中国南北方不同地理种群萱藻孢子萌发的影响

在实验设置的温度梯度下，实验第9天大连、温州萱藻孢子萌发率随温度的升高均呈先增大后减小的趋势(图2)。大连萱藻孢子萌发率在10～14 ℃随温度升高逐渐增大，14～20 ℃随温度升高逐渐减小，14 ℃下达到最大，实验第9天达(19.62±0.78)%，显著高于其他温度下大连萱藻孢子萌发率(P<0.05)。温州萱藻孢子萌发率在10～16 ℃随温度升高逐渐增大，在16～20 ℃随温度升高逐渐减小，16 ℃下达到最大，实验第9天达(19.94±1.45)%，显著高于其他温度下温州萱藻孢子的萌发率(P<0.05)。

图2 温度对大连、温州两个地理种群萱藻孢子萌发的影响(萌发第9 d)

显微镜检发现，实验第3天，12～18 ℃下大连、温州部分萱藻孢子膨大，色素体颜色加深，实验第5天，少量孢子开始萌发，形成萌发管(图版-2)。10 ℃温州萱藻孢子萌发较慢，实验第9天萌发率仅为(14.63±1.45)%，显著低于12～18 ℃温州萱藻孢子的萌发率。20 ℃下部分大连、温州萱藻孢子萌发后变绿死亡，且萌发率较低，实验第9 d分别为(13.67±0.34)%、(13.12±0.82)%，均显著低于其他实验组(P<0.05)，因此，20 ℃不适于大连、温州萱藻孢子萌发。综上所述，大连萱藻孢子萌发的适宜温度范围为10～18 ℃，最适温度为14 ℃，温州萱藻孢子萌发的适宜温度范围为12～18 ℃，最适温度为16 ℃。

2.3 温度对中国南北方不同地理种群萱藻幼配子体早期发育的影响

通过比较温度对大连、温州萱藻幼配子体生长的影响发现(图3)，在实验所设置的温度范围内，大连萱藻幼配子体生长的最适温度为12 ℃，培养30 d长度为(0.50±0.03) mm，显著高于其他温度条件下大连萱藻幼配子体长度(P<0.05)，温州萱藻幼配子体生长的最适温度为14 ℃，培养30 d长度为(0.41±0.01) mm，显著高于其他温度条件下温州萱藻幼配子体长度(P<0.05)。

图3 温度对大连、温州两个地理种群萱藻幼配子体生长的影响(培养30 d)

孢子萌发后形成幼配子体，15 d左右在固着器外围可观察到幼苗(图版-3)。12、14 ℃下大连、温州萱藻幼配子体生长状况良好，长度较长，且固着器外围幼苗较多(图版-4～7)。10 ℃温州萱藻幼配子体生长缓慢，培养30 d长度仅为(0.32±0.02) mm，固着器外围幼苗个数较少。18、20 ℃温州萱藻幼配子体生长较慢，培养30 d长度分别为(0.30±0.01)、(0.26±0.01) mm，均显著低于12～16 ℃下温州萱藻幼配子体长度(P<0.05)。培养30 d，18、20 ℃大连萱藻幼配子体长度分别为(0.25±0.02)、(0.21±0.01) mm，显著低于其他实验组(P<0.05)，且20 ℃下有部分萱藻幼配子体出现烂苗现象，藻体变绿(图版-8)。综上所述，大连萱藻幼配子体生长的适宜温度范围为10～16 ℃，最适温度为12 ℃，而温州萱藻幼配子体生长的适宜温度范围为12～16 ℃，最适温度为14 ℃。

图版 大连、温州两个地理种群萱藻孢子附着、萌发及幼配子体早期发育的显微图片

3 讨论

孢子生殖是海藻无性生殖的一种形式，孢子的游动及沉降速度会直接影响孢子的附着[25]。本研究发现，在10、12 ℃温度条件下，萱藻孢子游动速度快，可在较长时间内保持游动状态不附着，实验48 h时观察发现，仍然有大量游动的孢子，而当温度升高，萱藻孢子的游动时间变短，附着密度也相对变大，该结果与海带孢子在不同温度下的游动及附着情况相似[26]。海藻孢子的附着机制还与其分泌的粘液性碳水化合物有关，温度可能会通过影响粘液物质的分泌，从而阻碍孢子的快速附着[27]。20 ℃下大连萱藻孢子附着密度降低，该现象可能是由于此温度影响了大连萱藻孢子附着所需粘性物质的分泌，导致孢子附着不牢固。温州萱藻孢子附着的最适温度高于大连，该差异可能与南北方野生萱藻适应于当地的温度环境条件有关，温州属亚热带季风气候，纬度较低，秋季沿海平均温度比大连高3～5 ℃。在生产中，北方地理种群萱藻适宜的采苗时间一般在10月中旬到11月中旬。根据本实验研究结果，若以南方地理种群萱藻作为种藻，在北方沿海地区进行苗种繁育，可使采苗和育苗时间提前3—4周，进而延长萱藻生长期。当北方海区温度低至不适于萱藻采苗时，可选择以北方地理种群萱藻为种藻，在南方沿海地区进行采苗和育苗，来最大限度拓宽适宜萱藻采苗和育苗的时间范围，提高苗种产量。

孢子的附着、萌发是一个连续、动态变化的过程。本文研究发现，大连、温州两个地理种群萱藻孢子萌发的最适温度均低于其附着最适温度。因此，在育苗过程中，孢子附着后降低温度，有利于孢子的快速萌发。Van[28]等人通过比较欧洲不同地区萱藻孢子的萌发情况发现，高于14 ℃时，处于高纬度地区的冰岛萱藻孢子不能萌发，随着纬度降低，德国黑尔戈兰岛的萱藻孢子在低于17 ℃时才可萌发，而处于更低纬度的克罗地亚沿海萱藻孢子在21 ℃时仍可萌发，这表明随生长地区纬度的降低，萱藻孢子萌发的耐受温度逐渐升高。在本研究中，大连萱藻孢子萌发的最适温度为14 ℃，温州萱藻孢子萌发的最适温度为16 ℃，该结果说明随纬度降低，萱藻孢子萌发的最适温度逐渐升高。20 ℃均不适于大连、温州萱藻孢子的萌发，原因可能是高温影响了萌发管形成过程中细胞内含物的极化[29]，导致孢子萌发滞缓甚至死亡。

在加拿大东部沿海、澳大利亚东南部沿海等地区分布的萱藻配子体在5 ℃下可正常生长[30-32]，Orfanidis[33]发现希腊塞萨洛尼基海湾的萱藻配子体生长的最适温度为10 ℃。在本实验设置的温度范围和实验周期内，大连萱藻幼配子体生长的最适温度为12 ℃，温州萱藻幼配子体生长的最适温度为14 ℃，该结果说明在长期的进化过程中，由于南北方不同地理种群萱藻对温度的生态适应性不同，萱藻幼配子体生长的最适温度也不同。因此，在开展萱藻苗种繁育和养殖过程中，应结合海水温度和海区环境条件，调节育苗车间温度，促进幼苗生长。本文研究发现，高于16 ℃时，大连、温州萱藻幼配子体均生长缓慢，且在实验设置的20 ℃条件下，大连萱藻幼配子体出现烂苗现象，该现象说明较低温度条件更适宜萱藻幼配子体生长。王伟伟等[34]研究发现，褐藻酸降解菌产生的褐藻酸酶是引起海带藻体烂苗的根本原因，苗帘上褐藻酸降解菌的异常增加，使海带幼苗发生病烂。Cao等[35]的研究结果表明，高温会使PSII反应中心可逆失活或者完全受到破坏，阻碍光合作用。因此，在大连萱藻幼配子体早期发育过程中，较高温度(20 ℃)可能引起了褐藻酸降解菌的数量变化，菌藻互作导致萱藻烂苗现象的出现，也可能是由于较高温度导致了萱藻幼配子体发生光合系统损伤。海区水温变化对野生萱藻的生长和藻场形成有较大影响，我国东海海域野生萱藻的生长期比黄渤海海域野生萱藻生长期短[2, 36]，该现象可能是由于东海海域秋季平均水温较高，因此，若在南方沿海地区开展萱藻苗种繁育与人工养殖，应加强育苗车间水温的控制，促进幼苗生长，并在温度适宜的条件下尽早出库，以延长叶状体生长期。