沙棘果酒低温发酵还原糖指标的动力学研究

刘玉成，张俊琴

(1.河北金棘百益科技开发有限公司，河北石家庄 050000；2.河北神兴沙棘研究院，河北石家庄 050000；3.河北省卫生健康委综合监督服务中心，河北石家庄 050000）

沙棘含有大量营养成分，例如Vc，氨基酸，黄酮化合物，可强化人体对外界病毒与细菌的抵抗能力。通过发酵的方式，将沙棘加工成沙棘果酒，是当前国内对沙棘进行精加工的主要方向，要想使加工效果更符合预期，关键要明确发酵给沙棘所带来影响。发酵动力学所描述对象为微生物形成及生长过程，对发酵时长与底物消耗、菌体生长及产物合成的关系进行研究，对发酵类产品大规模生产有重要意义。过去，国内学者以桑葚酒为研究对象，利用既有模型对上述指标进行了非线性拟合，所取得效果良好。本研究以现有研究及所得出结论为依据，选择相应模型，对沙棘果酒发酵期间，其抗氧化性及其他指标进行研究，供相关人员参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

冷冻沙棘果的含糖量约为65 mg/mL，含酸量约为18 g/L，酸碱度约为3.0 °T，原产地为俄罗斯。本次实验所用材料，还包括安琪活性干酵母，白砂糖。

试剂及耗材：果胶酶的酶活为10000 U/mL。Vc、没食子酸以及芦丁标准品，均由国药集团提供。实验所用福林酚、草酸以及无水乙醇等化学试剂，属于国产分析纯。

仪器设备：手持折光灯由润联科技公司（河北）提供，型号为WS108；恒温水槽由森信仪器公司（上海）提供，型号为DK-08；离心机由湘仪仪器公司（湖南）提供，型号为L430；电子天平由奥豪斯公司（上海）提供，型号为EX326；打浆机由飞利浦电器公司（珠海）提供，型号为HR7633；光度计由凌析达公司（上海）提供，型号为UV-1100；显微镜由尼康公司（日本）提供，型号为YS100。

1.2 试验方法

1.2.1 更改沙棘果酒糖含量

对沙棘果酒进行发酵的流程为：沙棘果冷冻打浆—酶解处理—更改糖度—杀菌接种—发酵培养—分析测定。

沙棘果发酵的要点如下：第一，将沙棘果置于室温环境下，解冻，随后利用打浆机对其进行打浆处理，测定可溶固体物实际含量；第二，利用果胶酶将其酶解，在进行酶解操作时，温度需要控制在50 ℃左右，一般来说，酶解时长以3 h为宜；第三，添加适量白砂糖，确保糖度达到21 °Bx；第四，用1/3 沙棘汁、2/3 蒸馏水的混合溶液，将干酵母溶解，溶解后干酵母置于35 ℃环境下，进行30 min 的活化处理；第五，在接种工作正式开始前，相关人员应将发酵液置于60 ℃环境下30 min，待发酵液冷却到室温后，加入5 g/L 浓度的活化酵母菌，将实验温度控制在21 ℃左右，确保发酵液可尽快发酵。通常每隔24 h进行1次取样，重复3次取平均值即可。

既有模型对应拟合相关系数，精确到小数点后四位，分别是Logistic-0.9916，Boltzmann-0.9952，SGompeertz-0.9922。由此可见，具有良好拟合效果的模型为Boltzmann，研究人员计划利用该模型，对酒精生成情况进行拟合。实验结果表明，在发酵反应进行到第192 h时，酒精属开始结缓。

由表1 可知，既有模型中，可被用来对还原糖消耗情况进行拟合的模型，首选DoseResp 及Boltzmann，二者所得出结果精确度大致相同。

表1 还原糖动力学模型

1.2.2 测定发酵动力学相关数据

利用蒸馏水对发酵液进行稀释，将稀释后发酵液滴至血球计数板上，通过显微镜进行观察，确定酵母菌具体数量。利用二硝基水杨酸对还原糖实际质量浓度进行测定。利用密度瓶+蒸馏法，对果酒实时酒精度数进行测定。

1.2.3 测定果酒抗氧化性

DPPH 溶液配制的方法如下：第一步，称取DPPH 19.8 mg；第二步，利用95%体积分数的乙醇，将DPPH 完全溶解，获得0.5 mmol/mL 浓度的溶液；第三步，将溶液质量定容为100 mL，置于避光环境中保存，将环境温度控制在2～4 ℃间。

取DPPH 溶液0.5 mL、稀释样液2 mL，将充分混合所得溶液置于37 ℃的避光环境中，静置15～20 min。将无水甲醛设为空白，基于517 nm 对吸光度进行测定，测定结果记为A。

取DPPH 溶液0.5 mL、无水甲醛2 mL，将充分混合所得溶液置于37 ℃的避光环境中，静置15～20 min。将无水甲醛设为空白，基于517 nm 对吸光度进行测定，测定结果记为A。

取无水甲醛0.5 mL、处理样液2 mL，将充分混合所得溶液置于37 ℃的避光环境中，静置15～20 min。将无水甲醛设为空白，基于517 nm 对吸光度进行测定，测定结果记为A。

利用测定所得数据，对DPPH 清除率进行计算，公式如下：

在上述计算公式中，A代表DPPH 溶液+发酵液的真实吸光度，A代表DPPH 溶液吸光度，A代表发酵液吸光度，单位均为%。

对抗氧化能力进行测定所用方法为T-AOC。

上述实验均重复3 次，利用相关软件进行系统分析，确定可被用来研究酒精度、酵母菌和还原糖含量的模型。通过对拟合相关系数加以比较，确定满足定量描述要求的高拟合度模型。

1.2.4 测定其他指标

1.2.4.1 Vc含量

对Vc 含量进行测定所用元素为二氯靛酚，测定方法为滴定法。

1.2.4.2 总多酚含量

对总多酚含量进行测定所用方程见表2。相关人员可结合样品对应吸光度、标准曲线，对实际含量进行计算。

1.2.4.3 总黄酮含量

对总黄酮含量进行测定所用方程见表2。相关人员可结合样品对应吸光度、标准曲线，对实际含量进行计算。

表2 指标测定标准曲线方程

2 结果与分析

2.1 建立发酵动力学模型

实验表明，酵母菌进入衰亡期的时间节点为96 h。研究人员计划对酵母菌120 h 内发酵情况、酵母菌数量进行分析，通过对既有模型拟合系数进行对比可知，拟合效果最为理想的模型为SGompertz，该模型的相关系数约为0.96。通过拟合酵母菌大致生长情况可知，经过24 h 发酵的沙棘果酒，其酵母菌含量增速开始提升，通常在第96 h，酵母菌数量达到峰值。

2.2 还原糖含量、酒精度和酵母菌

酵母菌增长快速期为24～96 h，在此期间，酵母菌数量持续增长，随后，便过渡到稳定期，最终进入衰亡期。在96 h 时，酵母菌数量达到峰值，此后呈缓慢下降趋势，究其原因，主要是受还原糖浓度偏低及酒精浓度偏高影响，酵母菌过渡到平稳期并走向衰亡，随着菌体自溶，大量沉淀生成。

表3 酵母菌动力学模型

表4 酒精动力学模型

发酵时间和还原糖含量呈负相关，即发酵时间增加，还原糖含量减少。192 h 为还原糖消耗情况转折点，0～192 h 期间，还原糖被快速消耗，大量酵母菌向酒精进行转化，发酵时间达到192 h 后，消耗还原糖的速度逐渐放缓。沙棘果酒酒精度数的变化趋势与还原糖大致相同，在发酵操作进行到264 h时，酒精浓度最高，约为11.8%vol。

2.3 抗氧化性变化趋势

DPPH 清除率的变化趋势为先增后减，发酵时间延长，致使大量抗氧化物质被浸出，多酚含量随之增多。研究表明，酚类物质的共性特点，主要体现在两个方面：一是给出氢离子；二是经由共振杂化处理，使自身性质趋于稳定。这也是酚类物质普遍具有理想清除能力的原因，其DPPH 清除率自然可维持在较高水平。最佳发酵时间为72～120 h，这一时期的清除率明显高于其他时期。当发酵反应到72 h 时，果酒所对应的DPPH 清除率达到峰值，约为76 %。在发酵反应进行到第120 h 时，DPPH清除率开始下降，主要是发酵时间增加，致使Vc、多酚物质含量减少，清除能力随之减弱。

实验证实，处于发酵状态的沙棘果酒，抗氧化能力的变化趋势为先升后降，这一趋势和DPPH 清除率大致相同。当发酵时间达到72 h，抗氧化能力可达到峰值，测定结果为145 U/mL。该能力增强的原因，主要是Vc 以及多酚含量增多。待发酵进行到120 h，受活性成分占比减小影响，抗氧化能力将出现明显的下降趋势。

2.4 其他指标分析

2.4.1 Vc含量

Vc 含量变化趋势为先增后减。正常情况下，经过96 h 发酵的沙棘果酒，其Vc 含量将达到峰值，约为27 mg/100 mL。对沙棘果进行酶解处理，极易破坏沙棘果细胞壁，致使大量内容物流出，在发酵时间增加的双重影响下，沙棘果酒所含乙醇大幅增加，以Vc 为代表的活性物质含量，通常会出现明显波动。随着氧化程度以及降解反应加剧，Vc 含量将持续走低。

2.4.2 总多酚含量

多酚含量变化趋势为先上升后下降，实验测得果酒素汁含量较多的原因，可能是由于酵母菌的存在，使得大分子酚类被转化为小分子酚类。经过96 h 发酵后，多酚含量减少，主要是因为酵母菌的存在，加快了多酚物质氧化速度，这与山竹酒多酚含量与发酵时间的关系大致相同。

2.4.3 总黄酮含量

沙棘果酒含黄酮物质的变化趋势是先上升后下降，上升区间为24～72 h，发酵进行到72 h 时，黄酮物质含量达到峰值，约为12.5 mg/mL。在总发酵持续进行的背景下，素汁被大量占用，随着酒精含量的增加，黄酮物质浸素时间延长，溶解量出现明显变化。当发酵加工进入后期，黄酮物质含量增速趋于平缓，原因有两个：一是以乙醛为代表的诸多物质，均会和黄酮物质发生反应，致使大量衍生物生成；二是多酚出现氧化及分解反应，随着多酚含量减少，黄酮物质增速放缓。

3 结论

综上所述，通过实验可知，可被用来对沙棘果酒对应酒精生成、酵母菌生长及还原糖消耗情况进行拟合的模型，现阶段主要有Logistic、SGompertz、DoseResp 及Boltzmann，并且上述模型均可被用来对果酒发酵流程、相关反应以及动力学特征进行描述。研究结果表明，在发酵期间，沙棘果酒所含还原糖、Vc、总多酚以及总黄酮含量，抗氧化能力与DPPH 清除率，均呈先增后减的趋势，要想使沙棘果酒发挥出应有功效，关键是根据非线性拟合所得结果，对适宜发酵时长加以确定。