发酵工艺对白啤4-VG 含量的影响分析

张健唯，梁 宸，刘助水

（1.北京燕京啤酒股份有限公司，北京 100083；2.燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司，广西桂林 541002）

啤酒的风味质量包括啤酒的风味强度、风味组成和风味稳定性三个主要方面，啤酒的口感一致性和风味稳定性对消费者的影响比较直接、重要，受到啤酒行业的广泛关注，提高啤酒的口感一致性和风味稳定性也是啤酒行业面临的重要挑战。

酚类是构成啤酒活性风味物质的重要组成之一，已经检测出的有挥发性酚、愈创木酚、苯酚等，其中4-乙烯基愈创木酚（4-vinylguaiacol,4-VG）是小麦啤酒的特征性香气物质，具有挥发性，有独特发酵香气，嗅觉识别度较高，能够给小麦啤酒带来特殊香味。4-VG 并非天然存在于啤酒原料中，而是在生产啤酒的制麦、糖化和发酵各个环节中由阿魏酸发生脱羧反应。4-VG 的产生途径有两种：（1）前体物质阿魏酸经过高温热脱羧反应生成4-VG；（2）阿魏酸经过酶催化脱羧反应生成4-VG。

白啤是小麦啤酒的一种，关于糖化工艺参数对白啤4-VG 含量影响的研究较多，但关于发酵工艺参数对白啤4-VG 含量影响的研究不是非常完全。因此，本研究系统研究酵母菌种、酵母代数、酵母接种量、发酵温度、冷麦汁充氧量5 种发酵工艺参数对白啤4-VG 含量的影响，以期通过优化发酵工艺参数提高白啤中4-VG的含量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料和菌株：大麦芽（麦特卡夫），粤海永顺泰（广州）麦芽有限公司；小麦芽，欧麦(保定)麦芽有限公司；酵母菌株，燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司保藏。

试剂及耗材：乙腈（色谱纯），美国Fisher 公司；三氟乙酸（纯度99.5%），阿拉丁试剂（上海）有限公司；4-VG（纯度98%），德国Sigama公司。

仪器设备：液相色谱仪（规格型号：1200系列），安捷伦科技（中国）有限公司；紫外检测器，安捷伦科技（中国）有限公司；电子天平（精度0.0001 g），梅特勒-托利多集团；超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司精酿啤酒生产线（糖化麦汁单锅产量2 t，发酵一锅麦汁进罐），宁波乐惠国际工程装备股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦汁制备

原料配比为60%大麦芽+40%小麦芽，麦芽采用干法粉碎，下料温度38 ℃（保温时间10 min），蛋白质休止温度45 ℃（保温时间10 min），糖化温度63 ℃（保温时间30 min），糖化温度72 ℃（保温时间25 min），醪液升温到76 ℃后送入过滤槽，煮沸90 min（蒸发率控制8%），回旋沉淀30 min，麦汁冷却35 min（冷麦汁温度与发酵温度相同），充氧后进入立式发酵罐进行发酵。冷麦汁理化指标控制：原麦汁浓度12°P±0.3°P，氨基氮250 mg/L±20 mg/L，总酸1.6 mL/100 mL±0.1 mL/100 mL，pH5.6±0.1，色度10 EBC±1 EBC。

1.2.2 发酵工艺

根据实验需要，调整5 种发酵工艺参数。一是接种的酵母菌株，分别采用公司保藏的4 款上面酵母，编号为No.1、No.2、No.3、No.4，0 代酵母经实验室纯培，再用20 L卡式罐下种至精酿啤酒生产线进行扩培，最后根据发酵工艺的酵母接种量，将扩培液送入发酵罐，再将冷麦汁送入发酵罐；二是酵母代数，分别为0 代、1 代、2 代、3 代，除0 代酵母之外，其余代数的酵母通过酵母在线添加管道，在冷麦汁进罐0.1 t 且冷麦汁温度稳定后定量添加；三是酵母接种量，分别为4 百万个/mL、6 百万个/mL、8 百万个/mL、10 百万个/mL，除0 代酵母之外，其余代数的酵母通过使用ABER 活性酵母计数仪进行定量添加，从而达到试验酵母接种量的要求；四是发酵温度，分别为14 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃；五是冷麦汁充氧量，分别为18 mg/L、20 mg/L、22 mg/L、24 mg/L（mg/L表示每升冷麦汁充入氧气的质量），充氧后段使用蛇形管，以提高冷麦汁充氧的效果。

1.2.3 4-VG含量的测定

从发酵液满罐后第1 天起，每天上午定时取样，测量发酵液4-VG 含量。检测方法参考T/CBJ 3103—2020白啤酒团体标准中高效液相色谱法（第一法）进行测定。检测步骤大致如下：先制定标准溶液/校正曲线、控制样，再将样品经振荡脱气，先后经过单层中速滤纸、0.22 μm过滤头过滤，直接进样，最后进行结果计算，结果取小数点后一位。

2 结果与分析

2.1 酵母菌种对白啤4-VG含量的影响

试验将酵母菌株设置为变量，其余发酵工艺参数为：酵母代数0 代、酵母接种量6百万个/mL、发酵温度18 ℃和冷麦汁充氧量20 mg/L。酵母是啤酒的灵魂，它对啤酒风味起着决定性作用，接种不同酵母酿造出的啤酒风味各异，选择适宜的上面发酵酵母是产生白啤特色丁香香气的关键因素。

如图1 所示，4 种不同酵母酿造的白啤中4-VG含量差异明显。上面发酵酵母的POF（phenolic off-flavour）基因编码的阿魏酸脱羧酶能够催化4-VG 的前体物质阿魏酸脱羧生成4-VG，从而赋予白啤酚香味。上面发酵酵母中含有POF 基因，赋予小麦啤酒酚香味，根据酚香味的差异将上面发酵酵母分为POF+型和POF-型，POF+酵母比POF-酵母产生的酚香和丁香香气更加浓郁。能够酿造啤酒产生4-VG 含量高于2.5 mg/L 的酵母为POF+酵母，低于此含量的为POF-酵母。

图1 酵母菌种与4-VG含量的关系

试验的4 种上面酵母中，No.3 和No.4 发酵产生的4-VG 含量较高，No.2 发酵产生的4-VG 含量适中，No.1 发酵产生的4-VG 含量较少。此结果证明上面酵母No.3和No.4为POF+菌，上面酵母No.1和No.2为POF-菌。

在选择酵母的同时需要考虑其对白啤“酸感”带来的影响，口感过酸往往会降低消费者的体验感。乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸是白啤酿造过程中带来“酸感”的主要物质，不同酵母对以上4 种酸的代谢能力差别较大。本研究的检测和品评结果显示，上面酵母No.3 和No.4 酿造的白啤在产生4-VG含量合适的情况下，“酸感”表现良好。

2.2 酵母代数对白啤4-VG含量的影响

试验将酵母代数设置为变量，其余发酵工艺参数为：酵母No.3、酵母接种量6 百万个/mL、发酵温度18 ℃和冷麦汁充氧量20 mg/L。

如图2 所示，用0 代到3 代酵母酿造的白啤中4-VG 含量呈逐渐下降趋势，这与上面酵母中苯丙烯酸活性脱羧酶PADl(POFl)的作用效果有关。本试验使用立式发酵罐，采用一罐法进行酿造，只有在对发酵罐降温后，才能从发酵罐锥底得到足够多的上面酵母，从而进行传代投料试验，此时酵母已长时间处于缺乏营养状态，且初期沉降下来的酵母，其自身活力及脱羧酶活性相对较弱。随着酵母代数增多，白啤4-VG 含量会逐渐下降。根据本公司的研发生产经验，要想保持口感和风味的稳定性，对于大部分酵母来说，一般将代数控制在3 代以内为佳。这一论断也并不是绝对的，与酵母菌株的特性有关，有些酵母控制在第5 代也不会对生产造成明显的不良影响。

图2 酵母代数与4-VG含量的关系

2.3 酵母接种量对白啤4-VG含量的影响

试验将酵母接种量设置为变量，其余发酵工艺参数为：酵母No.3、酵母代数0 代、发酵温度18 ℃和冷麦汁充氧量20 mg/L。

如图3 所示，白啤中4-VG 的含量随着酵母接种量的增加而上升，当酵母添加量大于6 百万个/mL时，4-VG 的含量高于5 mg/L。接种量的多少直接影响发酵周期长短、酵母的生长繁殖速度、酵母峰值和风味代谢物质的含量。适宜的接种量可为酵母创造种群优势，排除杂菌的影响。接种量通过影响酵母的增殖数量和发酵速度，间接对白啤中4-VG等酚类物质产生影响。

图3 酵母接种量与4-VG 含量的关系

上面酵母的酵母接种量不建议太高，一般控制在15 百万个/mL 以内为佳。过高的酵母接种量，一方面会造成发酵液前期降糖速度偏快，出现溢泡现象，容易染菌；另一方面，酵母在高温下大量繁殖会导致酒液的杂醇和总酸含量增加，进而严重影响啤酒的口感协调性和可饮性，消费者会出现饮后“上头”的现象。

2.4 发酵温度对白啤4-VG含量的影响

试验将发酵温度设置为变量，其余发酵工艺参数为：酵母No.3、酵母代数0代、酵母接种量10百万个/mL 和冷麦汁充氧量20 mg/L。上面发酵酵母发酵温度通常高于下面发酵酵母，一般控制在15～25 ℃。发酵温度通过影响酵母新陈代谢的速度进而影响发酵所产生的风味物质含量。发酵过程中酶催化脱羧反应生成4-VG，合理控制发酵温度有利于酵母处于最佳生长繁殖状态及阿魏酸脱羧酶在最适反应条件下发挥催化作用，进而提高最终白啤中的4-VG 含量。一般情况下，发酵温度不同，白啤中4-VG 含量存在一定的差异，4-VG含量随发酵温度的升高而上升。

如图4 所示，当温度设置为16 ℃时，4-VG 含量上升速率较慢，且最终含量较低，说明此温度未能使酶充分发挥活性达到转化阿魏酸的目的；在18～20 ℃，4-VG 含量上升较快，说明温度在此区间内越来越接近酶的最适反应温度，酶的活性逐渐提高。考虑到啤酒生产中的能耗和发酵过程中会生成其他风味物质，酵母在代谢氨基酸和糖的过程中同时会产生杂醇，发酵温度过高会使啤酒中的杂醇含量过高、总酸偏高、苦味值低、泡沫性能差且容易染菌，对成品酒风味造成不良影响。当发酵温度超过20 ℃时，4-VG 含量的增幅小于醇类的增幅，醇类增幅相对较多，饮后易出现“上头”现象。

图4 发酵温度与4-VG含量的关系

2.5 冷麦汁充氧量对白啤4-VG含量的影响

试验将冷麦汁充氧量设置为变量，其余发酵工艺参数为：酵母No.3、酵母代数0 代、酵母接种量10百万个/mL和发酵温度20 ℃。

如图5 所示，白啤中4-VG 的含量随着冷麦汁充氧量的增加而上升，且在18～22 mg/L 范围内4-VG 含量上升较快。提高冷麦汁充氧量会提高酵母数的峰值，发酵罐内的酵母峰值越高，阿魏酸经过酶催化脱羧反应生成的4-VG 就会越多。当冷麦汁充氧量超过22 mg/L 时，4-VG 含量变化趋势逐渐平稳，此时冷麦汁的溶氧量已基本达到饱和状态，即使再提高冷麦汁充氧量，过饱和部分的氧在麦汁进罐过程中也会很快形成气泡逸出发酵罐，不能被酵母所利用，酵母数的峰值不会有明显提高，4-VG含量就不会再增加。

图5 冷麦汁充氧量与4-VG 含量的关系

值得注意的是，增加冷麦汁充氧量会提高酵母数的峰值，啤酒中杂醇和总酸的含量也会增加，总酯含量减少；充氧量过低不利于酵母增殖，会使乙醛含量上升、发酵周期延长。所以在设计冷麦汁充氧量时，不能单方面的考虑4-VG 含量，也需兼顾白啤其他指标。

3 结论

近年来，我国啤酒行业开始从扩大规模向提高档次的发展方向转变，各啤酒品牌相继推出白啤产品来布局高端市场。白啤具有特殊的丁香香气，酒体浑浊且泡沫丰富，口感饱满且苦味值较低。本文通过单因素试验研究了酵母菌种、酵母代数、酵母接种量、发酵温度和冷麦汁充氧量这5 种发酵工艺参数对白啤4-VG 含量的影响，其中酵母菌种的影响最大。对于白啤的酿造，应该提高4-VG 含量而突出其丁香的香气特征，但不能单一考虑此因素而影响乙醛、杂醇、总酸和总酯等指标的含量，对产品风味和口感造成损失，应该兼顾白啤风味的平衡性和稳定性、口感的一致性和可饮性。基于以上考量并经过多次试验验证，得到提高白啤中4-VG 含量的最佳发酵工艺参数为:以燕京漓泉公司保藏的No.3酵母为发酵酵母、酵母代数0代、酵母接种量10百万个/mL、发酵温度20 ℃、冷麦汁充氧量22 mg/L。在最佳发酵工艺条件下酿造出的白啤产品丁香香气特征突出，无其他异杂味，口感丰富、一致性和可饮性良好，酒体平衡、稳定、协调。本研究为酿造白啤工艺提供了参考依据。