高效液相色谱法同时测定阿胶糕中16 种防腐剂

赵艳霞，张栋，姜岩，郭莹，周维利，高天阳，谢强胜

(1.山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室，济南 250101；2.国家市场监督管理总局食品审评中心，北京 100070)

食品防腐剂是一种最为常见的食品添加剂，在食品加工中得到广泛应用[1-2]。食品防腐剂可有效保持食品的鲜度、防止食品变质腐败，延长食品的保鲜期与食用时间，给消费者日常生活带来极大便利。随着居民生活水平的提高，消费者越来越关注食品的安全性问题，对防腐剂的使用情况也越来越重视[3-4]。防腐剂的过量添加会对人体造成一定伤害[5-6]，目前防腐剂的应用已有滥用趋势，食品安全面临风险隐患。

阿胶糕是由阿胶、核桃仁、黑芝麻、冰糖及黄酒等加工制作而成，可滋阴润燥，对血虚、面色萎黄、眩晕、心悸、心烦不眠、肺燥咳嗽等病症有较好的滋补效果。为了延长阿胶糕的保存时间，防止其腐败变质，通常添加适量防腐剂。但是食入过量防腐剂对人体具有潜在的致畸、致癌和致突变性。

目前测定食品中防腐剂的方法主要有液相色谱法[7-11]、液相色谱-质谱联用法[12-14]、气相色谱法[15-17]、气相色谱-质谱联用法[18-20]等，尚无阿胶糕中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸等防腐剂的测定方法。为了解阿胶糕中防腐剂使用情况，并提高检验效率、节约成本，笔者建立了高效液相色谱法同时测定阿胶糕中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸等16 种防腐剂的测定方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-40D 型，日本岛津公司。电子天平：XSE205 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高速万能粉碎机：JFSD-100 型，上海嘉定粮油仪器有限公司。

恒温数控超声仪：Sb3200 型，昆山市超声仪器有限公司。

涡旋振荡器：Vortex-6型，长春乐镤科技有限公司。

超纯水机：Milli-QA-10 型，默克密理博实验室设备(上海)有限公司。

水杨酸、苯甲酸对照品：质量分数分别为99.9%、99.1%，中国食品药品检定研究院。

脱氢乙酸、苯氧异丙醇、2，6-二氯苯甲醇、σ-伞花烃-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、苄氯酚、三氯卡班对照品：质量分数分别为100.0%、95.2%、99.8%、99.9%、99.3%、99.1%、97.1%、99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司。

山梨酸、硫柳汞钠对照品：质量分数分别为99.5%、98.8%，安诺伦(北京)生物科技有限公司。

苯甲酸甲酯、对氯间甲酚、2，4-二氯苯甲醇对照品：质量分数分数为99.9%、99.7%、99.7%，北京坛墨质检科技有限公司。

碘丙炔醇丁基氨甲酸酯对照品：质量分数为99.0%，德国Dr Ehrenstorfer 公司。

甲醇：色谱纯，美国Sigma 公司。

磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、乙酸锌、亚铁氰化钾、盐酸、磷酸：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

阿胶糕样品：市售，共15 批次.

阴性样品：自制。

1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典Akzo Nobel 公司)；流动相：A 相为0.025 mol/L 磷酸二氢钠溶液(含0.02 mmol/L EDTA-2Na，pH 3.8)，B 相为甲醇，流量为1.0 mL/min；进样体积：10 μL；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：230 nm；柱温：35 ℃；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0.00～10.0 min 时A 相体积分数为55%，10.0～27.0 min 时A 相体积分数由55%渐变为30%，27.0～42.0 min 时A 相体积分数由30%渐变为15%，保持7 min，49.0～50.0 min 时A 相体积分数由15%渐变为55%，保持5 min。

1.3 溶液配制

16 种防腐剂标准储备溶液：质量浓度均为1 mg/mL，分别取水杨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、山梨酸、苯氧异丙醇、2，6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、对氯间甲酚、2，4-二氯苯甲醇、σ-伞花烃-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、苄氯酚、三氯卡班、硫柳汞钠各10.0 mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，摇匀。

16 种防腐剂混合标准溶液：质量浓度均为0.04 mg/mL，分别精密量取16 种防腐剂标准储备溶液各2.0 mL，置于同一只50 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，摇匀。

16 种防腐剂系列混合标准工作溶液：用甲醇将16 种防腐剂混合标准溶液稀释至各组分质量浓度均分别为20、50、100、250、500 ng/mL 的系列混合标准工作溶液，临用现配。

1.4 样品处理

取样品约20 g，置于粉碎机中粉碎，混匀。精密称取样品1.0 g，置于50 mL 塑料离心管中，加水10 mL，超声使样品溶散，加入0.03 mol/mL 盐酸溶液1 mL 和1%乙酸锌溶液-1%亚铁氰化钾溶液（体积比为1∶1）2 mL，用甲醇定容至25 mL，以3 500 r/min 转速离心5 min，取上清液，用0.22 μm 滤膜过滤，取续滤液作为待测样品溶液。同法制备阴性样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法选择

分别采用超声处理法和水浴回流提取法处理样品，考察不同提取方式对测定结果的影响。结果表明，超声提取法可完全提取出所测防腐剂成分，且超声处理方法简单、快速，故选择超声处理法。

将样品置于恒温数控超声仪中，分别超声提取10、30、60 min，考察不同提取时间对测定结果的影响。结果表明，超声提取30 min 溶液所得色谱峰面积大于超声提取10 min 溶液所得色谱峰面积，而与超声提取60 min 溶液相比，样品色谱峰面积无显著性差异，故选择超声处理30 min。

分别使用30%三氯乙酸溶液、1%乙酸锌溶液-1%亚铁氰化钾溶液对样品进行除蛋白方式考察。结果表明，使用1%乙酸锌溶液-1%亚铁氰化钾溶液去除蛋白，所得溶液色谱峰面积大于使用30%三氯乙酸溶液去除蛋白所得溶液色谱峰面积，故选择用1%乙酸锌溶液-1%亚铁氰化钾溶液去除蛋白。

2.2 色谱条件选择

固定其它分析条件不变，分别选择230、280 nm作为检测波长进行试验，结果发现，两种检测波长下样品测定结果无明显差异，结合文献[10]，选择检测波长为230 nm。

固定其它分析条件不变，分别选择磷酸二氢钠溶液-甲醇、磷酸二氢钠溶液-乙腈作为流动相进行试验，结果表明，选择磷酸二氢钠溶液-甲醇作为流动相时，色谱峰形尖锐，基线更平稳，故选择磷酸二氢钠溶液-甲醇作为流动相。

固定其它分析条件不变，分别选择柱温为30、35、40 ℃进行试验，结果表明，除保留时间略有不同外，测定结果无明显差异，故选择柱温为35 ℃。

2.3 线性方程与检出限

在1.2 色谱条件下，对16 种防腐剂系列混合标准工作溶液进行测定，以待测防腐剂的质量浓度(x，ng/mL)为自变量、色谱峰面积(y)为因变量进行线性回归，计算16 种防腐剂的线性回归方程和相关系数。以甲醇为溶剂，逐级稀释16 种防腐剂混合标准溶液，在1.2 色谱条件下进行测定，以3 倍信噪比对应的质量浓度作方法为检出限，以10 倍信噪比对应的质量浓度作为定量限。

16 种防腐剂质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表1。由表1 可知，16 种防腐剂的质量浓度在20～500 ng/mL 范围内线性良好，相关系数均不小于0.999 5。

表1 质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.4 加标回收与精密度试验

在阿胶糕阴性样品中添加3 种不同质量浓度水平的16 种防腐剂混合标准溶液，按1.4 样品处理方法平行处理3 份加标样品溶液，在1.2 色谱条件下分别进行测定，结果见表2。由表2 可知，16 种防腐剂加标回收率为98.8%～102.5%，测定结果的相对标准偏差为0.78%～2.36%，表明该方法精密度、准确度良好。

表2 加标回收与精密度试验结果

2.5 专属性试验

分别精密量取空白样品溶液、16 种防腐剂混合标准溶液和加标样品溶液各10 µL 进行分析，考察空白样品溶液中其它成分对待测成分色谱峰的干扰情况，结果如图1 所示。由图1 可以看出，阴性样品在标准品的各组分相应出峰时间位置处无杂质峰干扰，表明该方法专属性强。

图1 空白样品溶液、混合标准溶液和加标样品溶液色谱图

3 结语

建立了阿胶糕中16 种防腐剂高效相色谱测定方法，该方法样品处理简单，测定结果重现性好，灵敏度高，目标物色谱分离度好，方法专属性强，可以满足阿胶糕中防腐剂的定性与定量测定要求，为阿胶糕质量控制、安全评价提供了技术依据。