不明原因复发性流产患者血浆中PAI-1水平表达及其基因启动区4G/5G位点多态性分析＊

刘玉美 胡春青 唐晓勇 雷永革 李春容 蓝红

不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指孕 20周前连续发生2次或2次以上不明原因的流产，是妊娠期最常见的并发症之一[1]。URSA病因至今未明，随着分子生物学深入研究发现，其发病与血栓前状态有密切关系[2-3]。血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一种丝氨酸蛋白酶抑制物和纤溶酶原激活物的主要抑制因子，对纤溶活性具有重要的调节作用，是防止血栓形成的重要保护因素。有研究表明，PAI-1水平及其基因单核苷酸多态性（SNP）与URSA的发生发展及妊娠不良结局有密切关系，但不同地区存在很大差异[4-5]。为此，本研究对深圳市大鹏新区妇幼保健院URSA患者、健康育龄妇女PAI-1水平及其基因4G/5G位点SNP进行了调查分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年5月-2021年3月本院妇产科门诊及住院部就诊的URSA患者75例为URSA组，选择同期在本院妇产科门诊及住院部生育史正常的健康育龄妇女120例为对照组。诊断标准：URSA诊断参照有关文献[6]。纳入标准：URSA组患者符合上述诊断标准，均为原因不明流产，连续流产次数≥3次；对照组患者均既往无不良孕产史、无自然流产史，无死胎或胎儿宫内发育迟缓病史和无血栓性疾病史，且至少有一次正常妊娠史；近两个月未使用抗凝或促纤溶药物；未服用避孕药物。排除标准：伴有内科及内分泌系统疾病；怀孕期间有大量饮含酒精类饮品、含咖啡因类食品及剧烈运动等严重不良嗜好和生活习惯；男方精液常规及夫妻双方染色体异常；TORCH及生殖抗体检测等异常；凝血功能障碍；近期有使用补肾活血类中药或激素类药物。URSA组：年龄19 ～32岁，平均（26.13±5.92）岁。对照组：在孕和非孕，各60例；年龄20 ～31岁，平均（26.75±5.64）岁。两组年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。患者均知情同意并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会同意批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 AE275全自动酶标分析仪由深圳爱康生物有限公司提供；PAI-1试剂购于上海太阳生物技术有限公司；DNA提取试剂盒购于深圳亚能科技有限公司；ABI7500型实时定量突光聚合酶链式反应仪由美国ABI公司提供；基因SNP多态性分析试剂盒由华大基因科技公司提供。

1.2.2 标本采集 清晨空腹抽取所两组外周静脉血5 ml，其中3 ml加入到一次性无抗凝剂的干燥管内于室温静置 30 min 后，离心 5 min（3 500 r/min），用作PAI-1水平测定；其余的静脉血加入到乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝管内，混匀，用于PAI-1基因单核苷酸多态性分析。

1.2.3 PAI-1水平检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中PAI-1水平，操作均严格按试剂和仪器说明书进行，检测前对仪器进行保养、校正，检测时同时设计空白孔、阴阳孔及质控孔，待上述所有检测孔的OD值均在参考有效范围内才进行标本结果判读，否则重新进行检测。

1.2.4 PAI-1基因单核苷酸多态性分析 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法分析PAI-1基因启动子区4G/5G位点多态性，具体操作，（1）基因DNA提取：使用DNA提取试剂盒抽提全血基因组DNA。（2）引物设计：①4G上游引物，5’-GTCTGGACACGTGGGGA-3’； ② 5G 上 游 引 物，5’-GTCTGGACACGTGGGGG-3’；③阳性对照上游引物，5’-AGCTTTTACCATGGTAACCC-CTGGT-3’； ④ 共同下游引物，5’-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3’。（3）PCR反应体系：反应总体积为20.0 μl，其中 含 DNA 模板 3.0 μl，10×PCR 缓冲液 2.0 μl，25 mmol/L 的 MgCl22.0 μl，10 mmol/L 的 dNTP 1.0 μl，Taq DNA 聚 合酶 2.0 U，5.0 μmol/L 的 4G或5G引物1.0 μl，5.0 μmol/L的上、下游引物各0.4 μl。（4）PCR 扩增：95 ℃预变性 5 min，然后以 95 ℃变性 1 min → 58 ℃复性 1 min → 72 ℃延伸 1 min，反复循环 30 次，最后 72 ℃延伸 5 min。（5）电泳：取PCR扩增产物于30 g/L的琼脂糖凝胶上电泳40 min，并对电泳结果采用凝胶图像分析系统分析其基因型。PAI-1基因SNP分析由华大基因科技有限公司进行检测分析。

1.3 观察指标

两组均进行Hardy-Weinberg平衡检验，比较两组PAI-1水平，PAI-1基因启动子区4G/5G SNP，不同基因型URSA患者PAI-1水平。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组PAI-1水平比较

URSA组 PAI-1水 平 为（9.76±2.85）ng/ml，明显高于对照组的（5.23±1.09）ng/ml，差异有统计学意义（t=6.057 4，P＜0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验

URSA组和对照组PAI-1基因启动子区4G/5G位点SNP均检出5G/5G、5G/4G和4G/4G 3种基因型，经Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示两组均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡（ χ2=0.033 8、0.014 5，P＞0.05），说明抽样具有样本代表性。

2.3 两组PAI-1基因启动子区4G/5G SNP比较

URSA组PAI-1基因启动子区4G/5G位点的4G/4G基因型和4G等位基因检出率分别为41.33%和64.67%，均明显高于对照组的12.50%和35.00%（P＜0.05），且4G/4G基因型和4G等位基因患URSA的相对风险增加（OR=3.726 5，95%CI：1.603 4，5.925 3和 OR=2.382 5，95%CI：1.302 7，3.480 1），见表 1。

表1 两组PAI-1基因启动子区4G/5G SNP比较

2.4 不同基因型URSA患者PAI-1水平比较

携带4G/4G基因型URSA患者PAI-1水平为（12.03±3.17）ng/ml，明显高于5G/4G 基因型的（8.52±2.40）ng/ml（t=3.718 2，P＜0.05）， 而 5G/4G 基因型又明显高于5G/5G基因型的（6.78±1.34）ng/ml（t=2.902 1，P＜0.05），不同基因型患者 PAI-1水平比较差异有统计学意义（F=12.341 8，P＜0.05）。

3 讨论

URSA是临床上妇科较为常见的一种妊娠相关性疾病，发生率为0.5% ～2.5%，且呈逐年上升趋势，严重影响育龄妇女的顺利生育，对生育年龄夫妻造成巨大的社会及心理压力，这不仅损害育龄妇女的身心健康，还会引起一系列的家庭与社会问题[7]。但URSA发病病因不明，给临床诊疗及预防带来很大困难。因此，探索URSA病因、发病机制及相关影响因素，对其诊断、治疗及预防至关重要。

血液中促凝因子水平增高、抗凝物质水平降低及纤维蛋白溶解减少等原因均可引起妊娠期妇女血液呈高凝状态，导致胎盘微血管血栓形成，影响胎盘和胎儿血供，导致胚胎供血不足，甚至绒毛坏死，从而导致流产。同时凝血和纤溶系统功能紊乱也可引起胎盘组织内大量血栓形成和纤维蛋白沉积，进而导致流产[8-9]。而PAI-1水平升高是引起血液呈高凝状态的重要原因之一，也是引起动静脉栓塞的独立危险因素。有研究表明，URSA患者血浆中PAI-1水平明显升高，但具有地域性差异[10-11]。本研究结果显示，URSA组患者PAI-1水平比对照组高（P＜0.05），略高于陈婵[12]报道海南地区的（9.36±2.25）ng/ml，但明显低于马玉祥[13]报道陕西地区的（37.58±3.27）ng/ml，这表明PAI-1水平升高可能与URSA发病有密切关系，这可能与PAI-1水平升高加强其对纤溶酶原激活物抑制作用，导致胎盘微血栓生成时纤维蛋白沉积，胎盘床发生梗死，引起胎儿缺血、缺氧，从而引发URSA等有关。

PAI-1是组织重构过程中控制蛋白质水解的关键酶，位于7号染色体长臂，由8个内含子和9个外显子组成，其基因启动子区多个位点易发生突变，进而导致PAI与纤溶酶原激活物（PA）之间失去平衡，PAI-1可通过与PA结合形成稳定无活性的复合物导致胎盘组织广泛血栓形成[14]。有研究发现，PAI-1基因启动子区插入或缺失一个碱基，可影响其水平和活性，与URSA的发生发展及妊娠不良结局有密切关系，且存在地域性和种族性差异[15]。本研究结果显示，URSA组PAI-1基因启动区4G/5G位点的4G/4G基因型和4G等位基因频率均明显高于对照组（P＜0.05），且携带4G/4G基因型和4G等位基因患URSA的相对风险增加，这表明了PAI-1基因启动子区4G/5G位点存在多态性，且可能在URSA发病中发挥了重要的作用，其中4G/4G基因型可能是深圳大鹏新区URSA发病的危险易感基因。此外，结果还显示，不同PAI-1基因启动子区4G/5G位点基因型URSA患者PAI-1水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中携带4G/4G基因型患者PAI-1水平最高，与有关报道基本一致[16]。这可能与PAI-1基因启动区域4G等位基因的纯合型可能影响PAI-1基因转录，从而增加其水平表达有关。

综上所述，URSA患者PAI-1水平明显升高及其基因启动子区4G/5G位点呈多态性，其中4G/4G基因型和4G等位基因患URSA的相对风险增加，且不同基因型URSA患者PAI-1水平存在很大差异，其中4G/4G基因型可能是深圳大鹏新区URSA发病的易感基因。