骨髓间充质干细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡及炎症的影响

尚 羽，李康睿，叶 民，沈华超

(1.南京医科大学附属明基医院 神经内科，江苏 南京 210000；2.东部战区总医院 神经内科，江苏 南京 210000)

缺血性脑卒中是一种常见的神经系统疾病，是导致死亡或长期残疾的主要原因之一。这种致残事件是由栓子或血栓引起的脑血流量突然下降引起[1]。目前最有效的治疗策略是立即恢复脑血流量。然而，当血液供应恢复时，再灌注可能会损伤大脑，导致不良的临床结果和一系列病理生理事件，如炎症、细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能障碍[2-3]。虽然临床上常用溶栓剂治疗缺血性脑卒中，但其治疗窗狭窄等安全问题限制了其应用[4]。因此，探索防治缺血性脑卒中的新靶点至关重要。细胞疗法是治疗包括脑卒中在内的许多疾病的有前途的策略[5]。其中，间充质干细胞(MSCs)具有可用性、可快速扩增以及在同种异体移植中没有伦理和免疫问题等特点[6]。最近的研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可减少脑卒中后的梗死面积并改善神经功能，但确切的分子机制尚不清楚[7]。Toll样受体4(TLR4)是先天免疫系统的跨膜受体蛋白，属于I型跨膜糖蛋白受体家族。在脑缺血再灌注(I/R)过程中，内源性配体通过TLR4信号通路激活核因子-κB(NF-κB)，诱导产生大量促炎因子、趋化因子、粘附分子等分子，产生炎症级联反应，从而加剧脑组织损伤[8]。研究表明，在脑缺血再灌注条件下，TLR4基因敲除小鼠的梗死体积明显减少，NF-κB的活化和炎症因子表达减少[9]。以上发现提示TLR4介导的炎症反应通路有望成为预防和治疗缺血性脑卒中的重要靶点。为给缺血性脑卒中患者提供神经保护治疗的新视角，本研究主要从TLR4/NF-κB炎症通路入手，探讨BMSCs对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂仪器 TTC染液(Sigma公司)；TUNEL染色试剂盒(Roche公司)；ELISA试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)；BCA蛋白检测试剂盒(武汉博士德工程有限公司)；增强型ECL化学发光检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；TLR4、NF-κB p65,NF-κB p50、IκB抗体(Abcam公司)；荧光显微镜(Leica公司)；CO2恒温培养箱(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物和分组 8周龄雄性SD大鼠，体重250～280 g，所有大鼠都饲养在12 h光照/黑暗循环的动物房中，湿度为(60±5)%，温度为(22±3)°C，可以自由获取水和食物。所有方案均获得动物伦理委员会批准。将大鼠随机分为3组(每组n=8)：假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)、骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)。

1.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离和鉴定 首先，深度麻醉大鼠后断头于无菌条件下取出股骨和胫骨。将分离后的股骨和胫骨上附着的肌肉和韧带清除，然后用PBS冲洗胫骨和股骨骨髓腔获得细胞。然后，用含有细胞培养基的注射器将骨髓冲洗到离心管中。将细胞接种于添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。24 h更换培养基继续培养。当细胞汇合达到80%时，用胰蛋白酶消化细胞，进行传代处理。传至第3代后，用流式细胞仪分析细胞表面标记物来鉴定BMSCs。将骨髓间充质干细胞用胰酶消化成单细胞悬液，用一抗(CD34、CD45、CD29、CD90)染色30 min，然后根据说明书与相应的FITC二抗孵育30 min，最后将BMSCs悬浮在300 μL PBS中用于流式细胞术鉴定。

1.2.3 大鼠局灶性脑I/R模型构建和BMSCs移植 通过大脑中动脉闭塞(MCAO)建立大脑I/R 模型。首先，手术前用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠。将大鼠固定在手术台上，采用颈中线切口暴露并分离右侧颈总动脉、右侧颈外动脉和颈内动脉。将一根单丝尼龙缝线插入颈内动脉管腔，并向前推进至颈内动脉约18～22 mm，直至轻度阻力阻塞大脑中动脉的起始端。缺血90 min后，缓慢拉出尼龙缝线进行再灌注。Sham组只分离颈内动脉，不进行任何治疗。BMSCs组大鼠尾静脉单次注射3×106个BMSCs。MCAO组、Sham组大鼠尾静脉注射1mL生理盐水。

1.2.4 神经功能缺损评分 在I/R后72 h，采用改良神经严重程度评分法(mNSS)测定各组大鼠的神经活动，评估运动、感觉、反射和平衡功能。mNSS评分为0～18分，评分越高表示神经损伤越严重。

1.2.5 TTC染色 在I/R后72 h，通过用氯化2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色评估脑梗死体积。使用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后立即处死。迅速取出大脑并在-20℃下冷冻15 min，然后制作2 mm厚的冠状切片，并使用2% TTC染色10 min。使用Image-pro plus 6.0软件对图像进行拍照和分析。梗死体积的计算公式为(%)=(对侧半球体积-同侧半球正常部分体积)/对侧半球体积×100%。

1.2.6 TUNEL染色 制作脑组织石蜡切片，并切成4 μm厚度的组织片。切片在梯度酒精中脱水并与不含DNase的蛋白酶K在37℃下孵育30 min。PBS清洗3次，根据TUNEL试剂盒说明书进行TUNEL染色。载玻片用DAPI重新染色10 min，并在荧光显微镜下成像以评估细胞凋亡程度。每片随机获得5张图像，计算5张图像中TUNEL阳性细胞数的平均值。

1.2.7 酶联免疫吸附实验(ELISA) 解剖大鼠，腹主动脉采血，离心收集上清液。根据ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-1β的浓度。取大鼠脑组织，PBS洗涤，用含PMSF蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液匀浆。离心，收集上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性。最后用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值。

1.2.8 Western blotting 解剖大鼠脑组织并与RIPA裂解缓冲液混合裂解组织块，离心取上清液为总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒测定样品中的蛋白浓度。该蛋白在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳，然后转移到PVDF膜上。然后将膜与5%脱脂牛奶孵育2 h，并用TBST缓冲液洗涤3次。随后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，然后用TBST缓冲液洗涤3次。随后用与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育1 h。使用增强型ECL化学发光检测试剂盒进行显色。使用Image J评估平均灰度值，蛋白质条带强度归一化为β-actin。

2 结果

2.1 BMSCs的分离和鉴定 培养的BMSCs呈现典型的纺锤形形态。流式细胞术结果显示BMSCs的表面标志分子CD29(99.83%)和CD90(99.87%)呈阳性，CD34(0.46%)和CD45(1.33%)低表达(见图1)。

A：BMSCs的形态；B：流式细胞术检测BMSCs表面标志物CD34、CD45、CD29、CD90表达。

2.2 BMSCs对MCAO大鼠神经功能障碍的影响 结果显示，Sham组大鼠未出现任何的神经功能缺损症状，MCAO组大鼠出现了明显的神经功能缺损症状，mNSS评分较Sham组显著升高，BMSCs组大鼠的mNSS评分较MCAO组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见图2)。

*：与Sham组比较，P<0.05；#：与MCAO组比较，P<0.05。

2.3 BMSCs对MCAO大鼠脑梗死体积的影响 TTC染色结果显示，MCAO组大鼠出现了明显的脑梗死，BMSCs组大鼠的脑梗死体积较MCAO组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

2.4 BMSCs对MCAO大鼠脑组织和血清的氧化应激和炎症反应的影响 与Sham组比较，MCAO组大鼠缺血脑组织中SOD活性显著降低，MDA水平升高，大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6浓度显著升高；与MCAO组比较，BMSCs组大鼠缺血脑组织中SOD活性显著升高，MDA水平降低，大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6浓度降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见图4)。

*：与Sham组比较，P<0.05；#：与MCAO组比较，P<0.05。

2.5 BMSCs对MCAO大鼠脑细胞凋亡及相关蛋白的影响 与Sham组比较，MCAO组大鼠脑组织中凋亡细胞数量显著升高，Bax和caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少；与MCAO组比较，BMSCs组大鼠脑组织中凋亡细胞数量显著降低，Bax和caspase-3蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增加(P<0.05，见图5)。

A：TUNEL染色检测脑细胞凋亡情况；B：Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2的表达；*：与Sham组比较，P<0.05；#：与MCAO组比较，P<0.05；×400。

2.6 BMSCs对TLR4/NF-κB信号通路的影响 与Sham组比较，MCAO组大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65、NF-κB p50蛋白明显升高，IκB蛋白表达明显降低；与MCAO组比较，BMSCs组大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65、NF-κB p50蛋白明显降低，IκB蛋白表达明显升高(P<0.05，见图6)。

*：与Sham组比较，P<0.05；#：与MCAO组比较，P<0.05。

3 讨论

先前的研究表明，脑I/R损伤是导致成人神经功能障碍的主要原因，炎症、氧化应激和细胞凋亡是脑I/R损伤过程的3种主要机制，脑I/R损伤是世界范围内第二大最常见的致死因素，也是导致成人神经功能障碍的主要原因[10-11]。此外，炎症是脑I/R损伤的主要预防机制之一[12]。因此，抑制神经元炎症是治疗缺血性脑卒中的关键靶点。虽然来自动物研究的各种治疗方法得到了发展，但是缺血性脑卒中仍然缺乏理想的有效治疗方法[13]。有研究报道MSCs在局灶性脑缺血动物模型中具有有益作用[14]。然而，MSCs治疗后脑梗死体积减少和神经功能改善的潜在机制尚不清楚。

正如预期的那样，本研究结果与之前的报告一致，即移植BMSCs可以减少MCAO大鼠脑梗死体积，改善其神经功能缺损[15]。细胞凋亡在脑缺血后神经元死亡中起决定性作用，在血供减少后的早期随访期，半暗区尤其易发生细胞凋亡。因此，该脑区细胞凋亡的减少是治疗干预的主要目标之一[16]。既往研究表明，MSCs移植在局灶性缺血模型中具有抗神经元凋亡的作用[17-18]。炎症级联反应是脑缺血再灌注损伤的重要机制[19]。小胶质细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平在炎症级联反应中起重要作用。这些因子可诱导其他炎症介质，增强白细胞和内皮细胞的黏附，促进一氧化氮的合成，诱导氨基酸和自由基的生成，并引发多重级联反应，进而导致脑缺血脑区不可逆的神经元凋亡[20]。最近的研究表明，BMSCs对溃疡性结肠炎、脂多糖诱导的急性肺损伤和骨关节炎的炎症反应有很强的抑制作用[21-23]。本研究探讨了BMSCs对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，发现BMSCs通过抑制炎症、氧化应激和凋亡表现出显著的脑缺血再灌注损伤保护作用。

为了进一步确定BMSCs依赖神经保护的分子机制，我们研究了TLR4/NF-κB信号通路，该通路在缺血诱导的神经炎症和细胞死亡中起主要作用。Toll样受体(TLR)是一种跨膜蛋白，它将细胞外抗原信息转化为细胞内并引发炎症反应。TLR4是第一个被发现的TLR成员，通过识别和结合多种内源性和外源性配体在免疫防御和免疫调节中发挥作用。TLR4与其配体结合激活髓样分化因子88(MyD88)，后者将信号传递给IL-1受体相关激酶(IRAKs)家族的成员。随后，IRAKs与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)结合形成复合物，进而激活转化生长因子β激酶1(TAK1)。它进一步激活NF-κB诱导激酶(NIK)并磷酸化NF-κB抑制剂激酶(IKK)复合物[24]。活化的IKK复合物(IKKα和IKKβ)诱导IκB泛素化和降解，导致NF-κB激活，并易位至细胞核与炎症调节基因的启动子结合，可促进TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子的转录和合成，从而启动炎症级联反应[25]。既往研究表明，TLR4参与肝、肺、心I/R炎症损伤，并在脑I/R过程中诱导细胞凋亡[26]。NF-κB是一种转录因子，可以特异性结合众多基因的启动子和增强子，从而参与多种细胞功能，包括炎症、细胞增殖和凋亡。NF-κB在I/R损伤的激活中也起着至关重要的作用[27]。因此，阻断和减弱TLR4/NF-κB通路的激活可能是抗脑缺血所致脑损伤的关键机制之一。之前的研究报道BMSCs对NF-κB、JNK和MAPK有显著影响[28-29]，但BMSCs对TLR4的影响尚不清楚。本研究结果发现BMSCs显著抑制MCAO大鼠TLR4、NF-κB p65和NF-κB p50的表达，促进IκB蛋白的表达，表明BMSCs可能抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，提示BMSCs对缺血性脑卒中的影响，可能至少部分通过抑制TLR4/NF-κB信号通路起作用。

综上所述，本研究结果表明BMSCs对脑I/R损伤大鼠具有神经保护作用，并且BMSCs的抗炎和抗凋亡作用可能与抑制TLR4/NF-κB通路有关，从而支持BMSCs作为治疗缺血性脑卒中靶点的潜在临床价值。