水质生物毒性测量中藻类光合荧光参数与初始生物量的关系

陈敏，殷高方，赵南京，甘婷婷，谷梦园，亓培龙，丁志超，王璐，冯春，张小玲

（1 中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所，中国科学院环境光学与技术重点实验室，合肥 230031）

（2 中国科学技术大学，合肥 230026）

（3 安徽省环境光学监测技术重点实验室，合肥 230031）

（4 安徽大学，合肥 230039）

0 引言

微藻作为水生环境的初级生产者，个体小、繁殖快，对毒性反应敏感，是评价污染化学品生物毒性极其重要的工具［1-2］。但广泛使用的藻类生物测试指南，“淡水藻类和蓝细菌，生长抑制试验”（OECD 201）规定的指数生长测试至少需要72 h［3］，无法满足水质安全预警和污染物应急监测的需求。

荧光动力学方法作为一种非破坏性、非侵入性的技术，可在几分钟内获悉光合系统状态［4］，在实时检测和水安全应用方面具有潜在应用价值［5］。该技术提供了藻类光合活性的直接信息，早期在除草剂（光合抑制剂）上进行了大量的研究［6］，现在也被用于测试其他化学品的毒性，如重金属［7-8］、多环芳烃［9］等。

通过监测藻类荧光动力学变化过程可获取与光合系统密切相关的一系列光合荧光参数。这些参数对应着光合作用电子输运流的不同过程，快速反映有毒物质对光合系统的影响，是理想的生物毒性测试终点。目前基于这些参数的毒性数据也非常多，但由于毒性测试方案的不同，导致产生的毒性数据有较大差异［10］。因此，有必要进行相关测试条件的分析，减少实验室间的可变性［11-12］。在生长抑制试验中，因为需要生物量的积累，每个细胞的毒物可用性取决于毒物的初始浓度和细胞密度，初始生物量会显著影响藻类毒性试验的结果，所以“淡水藻类和蓝细菌，生长抑制试验”（OECD 201）中对初始微藻生物量有明确要求。SINGH P K 等也推荐使用较低生物量的藻样来进行藻类生长抑制毒性测试［13］。然而，这一结论在以光合荧光参数作为毒性测试终点时是否适用，至今无相关研究或可靠数据可证明。荧光动力学技术本质上是采用光学探测器来监测微藻体内的叶绿素荧光信号变化，所以本文以叶绿素浓度作为生物量的衡量，以蛋白核小球藻作为受试对象，分析在敌草隆短期暴露下，作为毒性测试终点的光合荧光参数与初始生物量的关系，为基于光合荧光参数的生物毒性快速检测方法建立提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 藻种培养与溶液配制

蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa，FACHB-5）为中国淡水水域的一种常见绿藻，具有分散均匀、不易粘壁的特性。因此本研究以蛋白核小球藻为受试藻种，采购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。该藻种培养在恒温摇床（MQD-S3R）中进行，光源为白色冷荧光灯管，培养条件为：温度25±1 ℃、转速120 r·min-1、光照强度120 μmol·m-2·s-1、光暗比12 h∶12 h。待藻液培养2～3 天，达到对数生长期，以其开展实验研究。

采用藻类分析仪（FluoroProbe，德国BBE公司）对培养至对数生长期的蛋白核小球藻进行叶绿素浓度（生物量）测量，并根据实验需要以灭菌后的BGII培养基对藻液进行稀释，获取一系列不同生物量的藻液，以开展不同生物量蛋白核小球藻对敌草隆（3-（3，4-dichlorophenyl）-1，1-dimethylurea，DCMU）响应研究。由于胁迫物质敌草隆（DCMU，阿拉丁（中国上海），纯度99%）在水中溶解度很低，因此使用二甲基亚砜（DMSO，阿拉丁（中国上海），纯度＞99%）作为溶剂配制DCMU 胁迫下蛋白核小球藻的待测样品，最终单个样品体积为50 mL，DCMU的浓度分别为0、1、2、5、10、20、40 μg·L-1（样品中DMSO 含量小于0.1%），所有样品以同样方式制得3份。

1.2 光合荧光参数获取

采用ACT2＆FastOcean FRR 藻类荧光系统（英国CTG 公司）对DCMU 胁迫下不同蛋白核小球藻的待测样品进行光合荧光参数测量，以分析DCMU 对不同初始生物量蛋白核小球藻光合荧光参数的影响。该系统由FastOcean 快速重复率荧光仪和ACT2 实验室系统组成。测量过程中，激发光源选择450 nm 的LED，光化光设置从0 到800 μmol·m-2·s-1共8 个光强值，获取待测样品的快速光曲线（Fast Light Curve，FLC），并得到如表1 所示的11 个光合荧光参数，单个样品测量周期约为3 min。

表1 由FRRf 获取的光合荧光参数［14］Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters obtained from FRRf［14］

2 结果与讨论

2.1 初始生物量变化时不同光合荧光参数毒性响应分析

图1（a）和图1（b）为10 μg·L-1DCMU 短期胁迫下（1 h 和3 h），不同初始生物量样品对应光合荧光参数的毒性响应情况，以处理组与空白组的比值（球型）表示。其中灰色实线（100%）表示空白组，球型分布于实线上方，表明该参数受到促进作用；球型分布于实线下方，表明该参数受到抑制作用。柱形指示的是不同光合荧光参数在初始生物量变化情况下获得毒性测试数据的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。

图1 短期胁迫下，不同初始叶绿素浓度对应的11 个光合荧光参数对10 μg·L-1 DCMU 的毒性响应情况Fig.1 Under short-term stress，the toxic response of 11 photosynthetic fluorescence parameters corresponding to different initial chlorophyll concentrations to 10 ug·L-1 DCMU

由图1 可知，参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ以及τes的毒性测试结果基本不随蛋白核小球藻初始生物量的变化而变化，当叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1的区间内变化时，10 μg·L-1DCMU 胁迫1 h 与3 h 时该六个参数测试结果对应相对标准偏差RSD 均低于5%，对应平均值分别为2.74%与3.12%；而参数Ek、F0、Fm、Fv和JVPⅡ，其测试结果则明显受到初始生物量的影响，当叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1区间内变化时，DCMU 胁迫1 h 与3 h 时五个参数测试结果对应相对标准偏差RSD 均高于10%，对应平均值分别为14.66%与17.27%。以上结果表明，当叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1的区间内变化时，短期胁迫下，光合荧光参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ以及τes对DCMU 的毒性测试结果更为稳定，不受测试样品初始生物量的影响。

2.2 光合荧光参数与生物量的相关性分析

为充分了解光合荧光参数与生物量（叶绿素浓度）的关系，分析参数与生物量的相关性是否对毒性响应稳定性造成影响，进一步测试了当蛋白核小球藻叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1的区间内变化时，未受胁迫状态下蛋白核小球藻11 个光合荧光参数数值随叶绿素浓度变化的规律，并分别计算了同一光合荧光参数在不同藻生物量下的相对标准偏差RSD，结果如图2。

由图2 可知，11 个光合荧光参数可分为两类，第一类为Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes，其数值基本不随叶绿素浓度的变化而变化，当叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1范围变动时，Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes测得数值的相对标准偏差RSD 分别为3.00%，3.66%，3.80%，3.67%，0.09%和7.74%，具有很好的一致性，说明这类参数只表征蛋白核小球藻的光合信息，与藻类生物量变化不相关。第二类参数为Ek、F0、Fm、Fv以及JVPⅡ，这些参数随叶绿素浓度变化表现出一定的变化趋势，其数值受生物量影响，其中Ek 与叶绿素浓度呈负相关，F0、Fm、Fv以及JVPⅡ与叶绿素浓度呈现正相关，说明这些参数的数值变化除了包含光合系统信息，也反映了一定的生物量信息。结合2.1 节所得结论，可知当初始生物量发生变化时，光合荧光参数与生物量的相关性会影响毒性测试结果的稳定，与生物量无关的第一类参数获取的毒性测试结果更稳定。

图2 11 个光合荧光参数数值随叶绿素浓度的变化趋势Fig.2 The trend of 11 photosynthetic fluorescence parameters with chlorophyll concentration

2.3 不同初始生物量对应光合荧光参数的毒性剂量效应分析

稳定敏感的毒性剂量效应分析是水质生物毒性测量的关键。由于涉及参数众多，为筛选出能与毒物建立良好剂量效应的参数，并针对该参数提出最佳的初始生物量区间，本研究以处理组与空白组的比值作为纵坐标，DCMU 的浓度为横坐标，利用Logistic 函数建立了不同初始生物量对应光合荧光参数的剂量效应曲线，得到了对应曲线的相关系数R2以及毒性数据EC20（产生20%效应对应的毒物浓度）、EC50（产生50%效应对应的毒物浓度），如表2。并以参数Fv/Fm、Fm为例，展示了DCMU 胁迫下，参数Fv/Fm、Fm及对应的毒性数据EC20随测试样品初始生物量的变化趋势，如图3。

表2 不同初始生物量下光合荧光参数获得DCMU 相关毒性数据（μg·L-1）及剂量效应曲线拟合相关系数R2Table 2 DCMU-related toxicity data（μg·L-1）and dose-effect curve fitting effect（R2）obtained by photosynthetic fluorescence parameters under different initial biomass

由表2 可知，在DCMU 胁迫下，第一类参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes均呈现出良好的剂量效应关系（R2＞0.9），第二类参数中只有F0、Fm以及Fv呈现出良好的剂量效应关系（R2＞0.9）。以EC50、EC20以及R2作为主要的分析参考依据（R2＞0.9，EC50和EC20数值较低），给出了当以参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes、F0、Fm以及Fv作为DCMU 毒性测试终点时测试样品初始生物量的最佳范围。对第一类参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes，最佳的藻类初始叶绿素浓度（生物量）范围为10～2 000 μg·L-1，在此范围内所获取的毒性数据EC20、EC50数值低且稳定，符合2.1 节所述结论，但是当初始叶绿素浓度为4 μg·L-1时，EC50与EC20明显偏高，分析原因是由于藻种具有群体依赖性［15］，过低的生物量会影响藻种的光合生理状态，本研究中也确实发现当叶绿素浓度降到4 μg·L-1，藻光合活性Fv/Fm发生了突降（图3（a））。对第二类参数F0、Fm与Fv，最佳的藻类初始叶绿素浓度（生物量）范围为200～1 000 μg·L-1，在此范围内所获取的毒性数据EC20、EC50数值低且稳定。此外，当初始叶绿素浓度为2 000 μg·L-1，剂量效应曲线的拟合效果较差；当初始叶绿素浓度在4～100 μg·L-1范围内时，叶绿素浓度越低，EC50与EC20越高。

图3 参数数值及对应DCMU 毒性数据EC20随初始叶绿素浓度的变化趋势Fig.3 The value of the parameter and the corresponding DCMU toxicity data EC20 change trend with the initial chlorophyll concentration

3 结论

本文以蛋白核小球藻为受试生物，研究了DCMU 短期胁迫下，作为毒性测试终点的光合荧光参数（Fv/Fm，Yield，α，rP，σPSⅡ，τes，Ek，F0，Fm，Fv，JVPⅡ）与初始生物量的关系。结果表明，当初始生物量发生变化时，光合荧光参数与生物量的相关性会直接影响到毒性测试结果的稳定性，可将光合荧光参数分为两类，第一类为Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ和τes，其数值与生物量变化不相关，只表征蛋白核小球藻的光合系统信息，该类参数获取的毒性测试结果不受初始生物量变化的影响，当初始叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1的区间内变化时，10 μg·L-1DCMU 胁迫1 h 与3 h 时该六个参数测试结果对应相对标准偏差的平均值分别为2.74%与3.12%；第二类参数为Ek、F0、Fm、Fv以及JVPⅡ，其数值受生物量影响，包含生物量信息，这类参数的毒性测试结果明显受到生物量波动的影响，稳定性变差，当叶绿素浓度在20～1 000 μg·L-1区间内变化时，10 μg·L-1DCMU 胁迫1 h 与3 h 时五个参数测试结果对应相对标准偏差的平均值分别为14.66%与17.27%。进一步的剂量效应分析结果表明，参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes、F0、Fm以及Fv在DCMU 胁迫下呈现出良好的剂量效应关系。另外根据EC50、EC20以及相关系数R2，给出了不同光合荧光参数作为毒性测试终点时，藻类初始叶绿素浓度的最佳范围：对参数Fv/Fm、Yield、α、rP、σPSⅡ、τes，建议范围为10～2 000 μg·L-1；对于参数F0、Fm与Fv，建议范围为200～1 000 μg·L-1。该结果为基于光合荧光参数的生物毒性快速检测方法的建立提供了重要依据。