加酶回流法提取广西凌云县特产川木瓜总黄酮的工艺优化

＊李振中 夏小燕 莫斯锐 李容 黄锁义

（右江民族医学院药学院，右江民族医学院广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室 广西 533000）

川木瓜也称皱皮木瓜，别名有贴梗海棠、贴梗木瓜、铁脚海棠、铁杆海棠、铁脚梨、川木瓜、宣木瓜。科属分类为蔷薇科木瓜属，是我国特有的珍稀水果之一，有很高的药用价值和食用价值。川木瓜的功效作用为健脾消食、抗疫杀虫、抗痉挛，具有防治高血压、肾炎、便秘和助消化、治胃病，对人体有促进新陈代谢和抗衰老的作用，还有美容护肤养颜的功效[1]。本试验以凌云县特产川木瓜为原料探究川木瓜中总黄酮的提取工艺优化。

1.材料与方法

(1)材料

①供试原料。蔷薇科川木瓜，产地为广西百色市凌云县，使用前晾干，粉碎备用。

②主要试剂。乙醇；纤维素酶，北京索莱宝科技有限公司；亚硝酸钠，西陇化工有限股份公司；硝酸铝，天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠，西陇化工有限股份公司；芦丁，上海源叶生物科技有限公司。

③主要仪器。冷凝管；500mL圆底烧瓶；数显恒温水浴锅HH-6，国华电器有限公司；旋转蒸发器RE-3000，上海亚荣生化仪器厂；FA1104型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-Ⅲ A循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

(2)试验方法

①芦丁标准溶液配制[2]。精密称定芦丁0.2000g，加蒸馏水并定容至100.00mL容量瓶中，稀释得0.20mg/mL芦丁标准溶液，于0℃条件下冷藏备用。

②样品溶液制备。称取广西凌云川木瓜干粉10g和纤维素酶50mg于200mL烧杯中，再加入醋酸-醋酸钠溶液（pH=4.5）40mL浸润，于50℃恒温下搅拌45min，移入500mL圆底烧瓶中。在80℃恒温条件下加入70%乙醇200mL回流提取90min，趁热抽滤，经旋转蒸发去除乙醇，浓缩液用水饱和正丁醇萃取，取上层液于500mL烧杯，置通风环境下将正丁醇挥发完全，得总黄酮浸膏。取少量70%乙醇将总黄酮浸膏溶解，移到25ml容量瓶中，再用70%乙醇定容到刻度线，于0℃环境下冷藏备用。取300μl样品溶液测定其中总黄酮化合物含量。

③确定测量波长[3-4]。在两支10.00mL容量瓶中，分别加入300μl芦丁标准溶液和样品溶液，再加入0.30mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置10min；加入0.30mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置10min；再加入1.00mL 5%氢氧化钠溶液，加水至刻度，摇匀，放置30min。以试剂空白为参比溶液。紫外可见分光光度计在200～800nm波长范围内进行波长扫描，结果二者均在510nm处有最大吸收，因此选择510nm为含量测定波长。

④芦丁标准曲线的建立[5]。精密量取0.00mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL 0.20mg/mL的芦丁标准溶液分别于10mL容量瓶中，加入0.30mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置10min；加入0.30mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置10min；再加入1.00mL 5%氢氧化钠溶液，加水至刻度，摇匀，放置30min。于510nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得图1，得到回归方程A=22.009c+0.0216，R=0.994，在试验测定范围内有良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线

⑤总黄酮的含量检测[6-7]。精密吸取样品液0.30mL，置10.00mL容量瓶中，按“1.2.4”测定方法测其吸光度值，根据回归方程计算样品中总黄酮的含量，并计算其提取率。川木瓜中总黄酮提取率的计算公式：

⑥正交试验设计[6-8]。根据单因素试验结果设计L9（3^4）探索乙醇溶液体积分数、料液比、回流时间、加酶量四个因素对川木瓜总黄酮类化合物提取率的影响。相关设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计

2.结果与分析

(1)单因素提取试验

①乙醇体积份数对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响。在回流提取中，选择不同体积分数的乙醇作为溶剂，所得不同的提取率见图2。根据相似相溶的原理，极性相似的情况下，川木瓜中的总黄酮类化合物与70%乙醇的极性最为接近，所以提取率最高。

图2 乙醇体积分数(%)对川木瓜总黄酮提取率的影响

②料液比对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响。由图3可以看出，在取样原料质量不变的前提下，提取过程中加入不同体积的乙醇对黄酮提取率也有不一样的影响。提取率首先从1:10g/mL到1:20g/mL缓慢上升，然后从1:20g/mL到1:40g/mL逐渐下降。造成这个现象的原因推测是因为乙醇的用量会影响川木瓜中提取出来的总黄酮在溶剂中的溶解，从而影响提取率。

图3 料液比(g/mL)对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响

③回流时间对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响。回流时间长短，对黄酮的提取也有一定的影响，随着回流时间的变化，提取率先是上升后下降。如图4所示，在90min前提取率缓慢上升，90min后，提取率骤降。90min前提取率低可能是因为原料还未反应完全，原料结构还没坏完全。90min后提取率低的原因可为溶解出来的总黄酮被持续的反应破坏了。

图4 回流时间(min)对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响

④加酶量对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响。在回流之前需要对原料进行酶处理。加的酶多少，对提取率存在较大影响。由图5可知，随着加酶量的增加，提取率先升后降，其中加酶50mg为最佳。少于50mg，一定量的原料的细胞壁未被破坏完全，所以总黄酮溶出得少。多于50mg，加的酶过多，酶的浓度对酶的作用产生自身抑制，从而导致提取率下降。

图5 加酶量(mg)对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响

⑤提取温度对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响。从图6看出80℃以下，总黄酮类化合物提取率一直为上升趋势，到80℃以上的温度提取率才缓慢下降。高温会影响原料中分子结构，随着温度升高，分子运动越剧烈，越容易脱离原有结构，进入到溶剂分子中去。温度高于90℃时，可能由于总黄酮结构受到高温破坏以致提取率下降。

图6 提取温度(℃)对凌云县特产川木瓜总黄酮提取率的影响

(2)正交试验结果

正交试验结果见表2。从表2可以看出，各因素对川木瓜总黄酮类化合物提取率影响大小依次为乙醇体积分数、料液比、回流时间、加酶量，最佳提取组合为A2B1C2D3，此条件下总黄酮提取率为0.2158%，高于正交试验其他组合。

表2 正交试验结果

(3)分析方法的评价

①精密度试验[9-10]。精密吸取样品溶液0.30mL置于5个10mL容量瓶中，平行5份，按“1.2.3”的方法测定。结果RSD值为1.26%，重现性试验符合要求。

表3 精密度实验结果

②稳定性试验。精密吸取样品溶液0.30mL于5个10mL容量瓶中，平行5份，按照上述方法于0min、30min、60min、90min、120min后测定吸光度，RSD为1.25%，结果表明在120min以内基本稳定。

表4 稳定性实验结果

③回收率试验。精密吸取配置的芦丁标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置10mL的容量瓶中，再分别加入“1.2.2”配制的样品待测溶液0.30mL，分别测定其总黄酮含量，计算加样回收率，RSD为1.38%。

表5 加标回收率实验结果

3.结论

采用广西凌云县特产的川木瓜作为原料进行总黄酮提取工艺优化探究，通过进行单因素试验和正交试验探索了乙醇体积分数、料液比、回流时间、加酶量、提取温度对总黄酮提取率的影响。最终得出的结论是在以乙醇体积分数为70%，料液比为1:10g/mL，回流时间90min，加酶量为70mg，提取温度为80℃等的五个因素水平为最佳提取条件，提取率高，为0.2158%。本试验方法操作简单，重现性、稳定性良好，可为广西凌云县特产川木瓜的开发提取提供优化依据。