USP9X与MCL-1在鼻咽癌中表达及预后分析

冯燚源 杨晶 张雪 李珊珊 李源泉 杨洪斌

(川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充 637000)

Expression and prognosis of USP9X and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma

FENG Yi-Yuan,YANG Jing,ZHANG Xue,etal.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of USP9X and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma and their correlation with the prognosis of nasopharyngeal carcinoma.Methods100 patients with nasopharyngeal carcinoma were selected,their cancerous tissues were extracted as the observation group,and then 100 normal nasopharynx tissues were extracted as the control group.The expression of USP9X and MCL-1 in the two groups were detected by immunohistochemistry Envision method.The expression of USP9X and MCL-1 were observed in nasopharyngeal carcinoma patients with different tumor stages,infiltration depth and lymph node metastasis.USP9X and MCL-1 positive nasopharyngeal carcinoma patients were treated with radiotherapy and chemotherapy,and their cancer cells were extracted for cell culture.Western blot was used for protein quantitative analysis to observe the expression of Usp9x and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma patients with positive USP9X and MCL-1 before and after radiotherapy and chemotherapy.ResultsThere were 72 USP9X-positive patients in the observation group and only 2 in the control group.The data of the two groups were statistically significant (χ2=6.937,P=0.001).There were 75 MCL-1 positive patients in the observation group.There was only one person in the control group,and the data between the two groups was statistically significant (χ2=7.634,P=0.001);the levels of USP9X and MCL-1 were related to tumor stage,depth of invasion and lymph node metastasis,and the more serious the disease was,the more obvious the expression of USP9X and MCL-1 were(P<0.05);After radiotherapy and chemotherapy,the expression of USP9X and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma patients were significantly decreased (P<0.05),and Western blot also showed that the protein expression were significantly decreased (P<0.05).ConclusionsUSP9X and MCL-1 are highly expressed in nasopharyngeal carcinoma patients,and their expression are significantly decreased after radiotherapy and chemotherapy,which could be used as one of the diagnostic criteria for the prognosis of nasopharyngeal carcinoma.

【Keywords】 USP9X;MCL-1;Nasopharyngeal carcinoma

鼻咽癌是我国南方地区常见的恶性肿瘤之一，病死率较高且呈逐年上升趋势〔1〕，早期鼻咽癌患者以放疗为主，晚期以放化疗相结合的方式为主〔2〕，有研究〔3〕表明鼻咽癌治疗结果不仅与肿瘤分期、蔓延程度及有无淋巴结转移等相关，还与患者的自身情况有关，因此探寻肿瘤的发病机制，对鼻咽癌的诊断及治疗预后等方面具有重要意义。本文探讨X染色体连锁的泛素特异肽酶9(USP9X)与髓细胞白血病基因(MCL)-1在鼻咽癌中表达及其与鼻咽癌预后的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2018年1月至2019年1月在河北医学院附属医院经病理确诊为鼻咽癌的患者100例，纳入标准〔4,5〕：①所有患者经病理证实为鼻咽癌；②所有患者在检查前2 w内未有感冒、发烧等急性感染。排除标准〔6,7〕：①严重心脏、肝脏等重要脏器衰竭者；②严重认知功能障碍，不能配合检查者；③乙肝等传染性疾病者。其中男54例，女46例，平均年龄(56.85±16.23)岁，所有患者临床资料完整；再选取健康体检人群100例，其中男48例，女52例，平均年龄(58.62±15.69)岁。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已取得入组对象同意及伦理委员会批准。

1.2方法 提取鼻咽癌患者癌变组织作为观察组，提取100名健康体检人群的鼻咽组织作为对照组，采用免疫组化Envision法检测两组USP9X与MCL-1的表达情况，探讨观察组中不同的肿瘤分期、蔓延程度及有无淋巴结转移情况下，USP9X与MCL-1的表达情况。对观察组USP9X与MCL-1阳性的鼻咽癌患者进行放化疗，提取USP9X与MCL-1阳性鼻咽癌患者的癌细胞进行细胞培养，采用Western印迹法进行蛋白定量分析相比得出各目的蛋白的相对灰度值，观察USP9X与MCL-1阳性的鼻咽癌患者放化疗前后USP9X与MCL-1的表达情况。

免疫组化Envision法：将蜡块切成适宜厚度的组织切片进行脱蜡，将脱蜡后的切片过1遍蒸馏水，放入过氧化氢溶液中浸泡，避光处理〔8〕，流水冲洗，再过蒸馏水，采用柠檬酸盐和EDTA进行抗原修复，置于4℃环境过夜孵育一抗〔9〕，复温后孵育二抗，在切片上滴加二氨基联苯胺(DAB)溶液，将切片置于苏木素中复染，最后将切片脱水晾干后封片〔10〕。阳性判断标准：USP9X及MCL-1均定位于细胞质内，胞质内有棕黄色颗粒者判读为阳性细胞〔11〕。每张切片随机选择 5 个具有代表性的视野，在高倍镜(×400)下进行观察。根据染色强度和阳性细胞比例判定是否为阳性〔12〕。染色强度〔13〕：无色计 0 分，浅黄色计 1 分，棕黄色计 2 分，棕褐色计 3 分；阳性细胞百分比〔14〕：≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2 分，51%～75%计3分，>75%计4分；总分为染色强度与阳性细胞百分比的乘积〔15〕：≤4分为阴性，>4分为阳性表达。

Western印迹：首先依据USP9X及MCL-1蛋白分子量的大小选择最佳分离胶的浓度来配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)〔16〕，凝胶缓缓加入双层玻璃板夹层内，完全变干再加入浓缩胶将双层玻璃板填满，待浓缩胶完全凝固后，将玻璃板放入电泳槽中静置10 min左右，观察玻璃板有无漏液，确定无漏液后开始上样〔17〕，上样结束后接通电泳仪电源，调节电源电压至90 V，当溴酚蓝与样品接近分离胶的底部时结束电泳，电泳时长120 min左右〔18〕，选取恰当的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，浸泡于甲醇中15 s，激活后放入转膜液中进行转膜，调节电流为200 mA，具体转膜时间依据目标蛋白的分子量大小而定〔12〕。 使用5%脱脂奶粉配制的封闭液进行封闭，再将5%脱脂奶粉稀释至适宜浓度进行孵育一抗〔19〕，将配制好的液体置于摇床上，4℃恒温过夜，第二天取出配制好的液体，使用PBS进行洗涤后进行孵育二抗，放置在 37℃孵箱中孵育 70 min左右，使用BCA法〔20〕测定蛋白浓度，再使用 Image lab软件分析显影条带的相对灰度，将USP9X、MCL-1蛋白的相对灰度与内参(α-Tubulin)相比得出各目的蛋白的相对灰度值〔21〕。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行χ2检验，t检验，Pearson 线性相关分析。

2 结 果

观察组与对照组USP9X阳性(72例 vs 2例)MCL-1阳性(75例 vs 1例)相比具有统计学意义(χ2=6.937、7.634，均P=0.001)。

肿瘤分期Ⅲ+Ⅳ期USP9X与MCL-1阳性检出率明显高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，肿瘤蔓延程度T3+T4期阳性检出率明显高于T1+T2期(P<0.05)，有淋巴结转移的患者阳性检出率明显高于未发生淋巴结转移的患者(P<0.05)。见表1。

USP9X阳性放化疗后仅剩31例，放化疗前后相比差异有统计学意义(χ2=5.732，P=0.034)；MCL-1阳性放化疗后仅33例，放化疗前后相比差异有统计学意义(χ2=6.039，P=0.029)。

放化疗前USP9X平均相对灰度值为2.983±0.307，放化疗后为1.572±0.278，放化疗前后差异有统计学意义(t=6.732，P=0.001)；放化疗前MCL-1平均相对灰度值为1.798±0.203，放化疗后为0.579±0.135，放化疗前后差异有统计学意义(t=6.987，P=0.001)。

表1 USP9X、MCL-1在不同的肿瘤分期、蔓延程度及有无淋巴结转移情况下阳性检出率对比〔n(%)〕

3 讨 论

鼻咽癌是头颈部常见的恶性肿瘤，近年来鼻咽癌的发病率呈上升趋势，病死率较高，但若能在鼻咽癌早期进行干预治疗，患者生存率将大幅度提高，因此尽早确诊鼻咽癌对患者预后至关重要，目前临床上常用来诊断鼻咽癌的标准之一为检测到人类疱疹(EB)病毒〔22〕，但临床数据显示EB病毒第四型诊断鼻咽癌的特异性并不高，如淋巴瘤及病毒性感冒的患者中EB病毒检测也呈阳性，且EB病毒的检测较繁琐，需要检测与其相关的4种抗原〔23〕。本研究结果表明，可以初步将USP9X与MCL-1作为临床诊断鼻咽癌的标准之一。 USP9X的本质是一种特异性的去泛素化酶，有研究〔24〕表明USP9X大部分定位于细胞质与细胞膜交界的凹陷处，也可存在于特定的细胞核和线粒体内，可参与细胞凋亡的过程，USP9X可与ASK1相互作用，从而抑制细胞凋亡〔25〕。本研究结果表明肿瘤的恶性程度越高，USP9X的阳性检出率越高，而患者的预后往往与病理分期有关，因此可以初步推断USP9X可以用于评估鼻咽癌患者的预后。本研究结果证实了USP9X可以用于评估鼻咽癌患者的预后，且有研究〔26〕表明，USP9X的低表达可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性。 MCL-1本质上是一种抗凋亡蛋白，对维持细胞的存活、分化具有重要意义。有研究〔27〕表明，MCL-1的过表达与患者的不良预后有关，这一结论也与本研究结果相符，本研究结果同样说明MCL-1的阳性检出率与患者预后密切相关。MCL-1可以用于评估鼻咽癌患者的预后。有研究表明USP9X与MCL-1之间呈正相关，随着USP9X阳性检出率的下降，MCL-1的阳性检出率也随之下降，分析原因认为，MCL-1 是 USP9X 的特异性底物之一，USP9X 能通过去泛素化作用保护MCL-1免于被降解，从而稳定MCL-1，保证了肿瘤的生存条件〔28〕。

综上，鼻咽癌的早诊断早治疗对患者生存率具有至关重要的作用，USP9X与MCL-1在鼻咽癌中呈高表达，且在放化疗后表达显著降低，可作为临床诊断及评价鼻咽癌患者预后的标准之一。