野生红菇菌分离纯化及其抑制病原真菌作用研究

穆燕， 赵文君， 艾鑫， 律凤霞

(牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157012)

红菇(RussulalepidaFr.)属担子菌纲、伞菌目、红菇科，秋季林下群生或单生的菌根真菌。广泛分布于我国各林地。子实体含有5种多糖、28种脂肪酸，富含蛋白质和倍半萜等活性物质。味甘性温，长期食用可益寿延年，有滋阴补虚、清凉解毒、抑抗肿瘤的功效，少数有毒[1-2]。红菇较高的食药用价值倍受食用者和学者们的关注和研究，而红菇的季节性出菇和人工栽培的低产特性限制了其价值应用。有学者研究及报道证实，许多大型真菌具有天然的抑病菌效果，既能提供食药用成份[3-4]，也可替代抑菌防腐的化学药剂，达到植物病害生物防治的目的[5-6]。实验分离纯化野生红菇菌丝体，对其代谢物质抑制植物病原真菌的作用进行了初步研究，探讨红菇菌丝体在植物病害防治中的应用价值[7]，为弥补红菇子实体季节性缺失提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

红菇菇蕾：秋季野生蘑菇生长季节林下采集。

真菌DNA 提取试剂盒：QIAGEN公司产品；

PCR Mix试剂盒：宝生物有限公司产品；

水稻稻瘟菌：牡丹江师范学院微生物实验室提供。

其他常用试剂：国产分析纯。

1.2 试验仪器及培养基

分析天平；恒温振荡培养箱；自动高温蒸汽灭菌锅；超净工作台；PCR扩增仪；恒温水浴锅等。

孟加拉红培养基(分离纯化时使用抑细菌)：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁(无水)0.5 g、琼脂20 g、孟加拉红0.03 g、氯霉素0.1 g(乙醇溶解后加入)，定容至1000 mL，分装后灭菌备用。

PDA培养基(抑菌培养时使用)：200 g去皮马铃薯(加水煮沸10 min取滤液)、葡萄糖20 g、琼脂20 g、定容至1000 mL，分装后灭菌备用。

2 试验方法

2.1 野生红菇菇蕾(子实体)采集及组织分离

组织法分离菌丝[8-10]：野外采集的红菇菇蕾带回实验室，无菌环境下75%酒精快速清洗菇体表面，徒手掰开菌盖，无菌刀割取内部菌肉组织，接种至孟加拉红培养基平板中，恒温(26 ℃)倒置暗培养，随时观察菌丝生长及是否污染，多次转接筛选菌落单一无污染的培养平板。

2.2 红菇菌丝体与子实体遗传同一性鉴定

菌落单一无污染的分离培养物继续暗培养至菌膜形成，分别提取子实体和菌膜DNA， 以真菌ITS通识引物对DNA进行PCR扩增，扩增体系及反应条件如表1。

表1 PCR反应体系及反应条件

PCR产物经琼脂糖凝胶(1%)电泳，目的条带清晰的PCR产物外送测序，测序结果经NCBI网站BLAST比对，确定所测序列的种属并验证菌丝体和子实体序列是否同一[11-12]。

2.3 红菇代谢液制备及pH值测定

分离纯菌丝体转接至液体培养基，恒温振荡培养(26 ℃，150 r/min)，10 d后每隔2 d无菌条件下取培养液测pH值，直到培养液pH值趋于恒定(约20 d)，培养液无菌条件过滤备用。

2.4 红菇与水稻稻瘟菌的抑菌实验

对峙培养：用记号笔将无菌培养皿(直径9 cm)底皿在直径上平分三段标记两个三分点，无菌条件下倒PDA培养基平板，凝固后在两个标记点对应接种红菇和水稻稻瘟菌，两菌块相距3 cm；重复三板。封口膜封边后倒置恒温(26 ℃)暗培养，待两个菌落生长到彼此接触后，观察菌落形态及菌丝间的拮抗及抑制效果。

添加红菇代谢液培养水稻稻瘟菌：将红菇代谢液(2.2制备)按0 %、25 %、50 %、75%、100 %的浓度梯度添加到常规PDA培养基中，分别接种已活化的稻瘟病菌，三个重复，封口膜封边恒温暗培养，待稻瘟病菌明显萌发后，每隔5 d测量稻瘟病菌菌落生长直径，计算抑菌率。

3 结果与分析

3.1 红菇子实体形态特征初鉴别

野生红菇子实体中等大小，菌盖中部色深红至暗(黑)红，边缘红色较淡，菌肉白色，菌盖表面覆少许鳞片，菌柄长柱或稍弯曲，纤维质，符合红菇子实体表型特征(如图1)。

图1 野生红菇子实体

3.2 红菇组织分离培养

多次转板分离的菌丝体在孟加拉红培养基中呈现白色致密菌丝(如图2)。

图2 红菇组织分离培养物

3.3 红菇分离菌液体培养

红菇纯化菌恒温振荡液体培养15d后得到大小均匀的白色菌球，代谢液清澈，菌球清晰可见(如图3)，pH值恒定为3.44，无菌过滤得清澈滤液。

图3 红菇分离菌液体培养

3.4 红菇子实体及菌丝体DNA分子鉴定

分离菌菌膜与子实体同时提取DNA，以真菌ITS通识引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖电泳分离(如图4)。

图4 DNA的PCR(真菌通识引物)产物电泳图

图5 PCR产物序列BLAST比对结果

1-2泳道：子实体DNA；3-4泳道：菌丝体DNA 见：子实体和菌丝体DNA的PCR产物在约700bp处出现目的条带，测序后比对子实体和菌丝体PCR产物序列相同；测序序列经网站Nucleotide BLAST比对，与网站公布MK532813.1同源性达100%，确定采集的子实体和分离的纯培养物为东北红菇[9](如图4)。

3.5 红菇对水稻稻瘟菌的抑菌效果

平板对峙培养如图6-a所示：三组稻瘟菌菌丝生长空间极小，即红菇菌株对稻瘟菌生长的抑制效果显著，且明显降解并阻抑了稻瘟菌黑色素分泌。

a为红菇与稻瘟菌对峙试验；b为红菇代谢液对稻瘟菌抑制试验

红菇代谢液pH值恒定至3.44后无明显变化，不同比例添加至PDA固体培养基接种稻瘟菌。图6-b显示：红菇代谢液对稻瘟菌丝生长有抑制作用但差异不显著(表2)，而表现明显的是添加代谢液的稻瘟菌均表现为气生菌丝量增加，其原理及生产应用价值有待后续研究验证；从培养皿背面图可见：添加红菇代谢液的稻瘟菌黑色素分泌均受显著抑制，大于75 %添加量时对稻瘟菌黑色素分泌表现完全抑制效果。

表2 添加代谢液培养稻瘟菌菌落直径及差异分析

4 结论

无需特殊培养条件，红菇子实体经组织分离可获得遗传一致的菌丝体及代谢液，红菇菌株对水稻稻瘟菌有显著的拮抗及抑制作用，其代谢液对稻温菌的生长量抑制不显著，但可阻隔其黑色素分泌，而产生黑色素的植物病原真菌，其黑色素是侵染植物的必要条件，红菇代谢液对不同致病菌抑菌效果的差异可通过提高添加浓度和纯度进一步进行研究，但其产生酸性代谢液是其抑菌的主要物质基础。因此红菇及其代谢液在水稻稻瘟病生长防治有研究应用价值。菌丝体的培养弥补了子实体季节性生长的限制，为野生红菇的生物防治价值的研究应用奠定基础。