miR-146b-5p对骨肉瘤细胞增殖抑制及克隆形成的机制研究

姜富祥，阿尔宾，高 飞，王 兴

（内蒙古自治区巴彦淖尔市医院脊柱外科，内蒙古巴彦淖尔 015000）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种高度恶性的骨架癌，起源于间充质组织中梭形细胞的未成熟类骨质基质，是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤[1-2]。目前手术、放化疗是OS的主要治疗方式，针对OS的靶向治疗药物仍在研究[3]，然而临床治疗效果有限，故深入研究OS的发生发展机制，找寻针对OS的新的有效治疗方法及分子标志物意义重大。微小核糖核酸分子（micro RNA，miRNA）是具有15～25个核苷酸的小非编码RNA（small non-coding RNA）调控分子，其可与基因3’UTR区结合发挥功能，具有广泛的生物学功能，研究证实miRNA参与了细胞凋亡、新陈代谢、发育、增殖和细胞分化等生物学过程[4-7]。近年发现，miR-146b-5p与许多人类恶性肿瘤有关，例如在乳腺癌中，lncRNA NEAT1通过抑制miR-146b-5p表达可促进人乳腺癌细胞的增殖、迁移和转移[8]。miR-146b-5p通过调节IRAK1/NF-κB通路提高非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制剂的敏感度[9]。证实miR-146b-5p可抑制上皮间质转化及细胞迁移和侵袭等多种致癌途径[10-12]，在人类多种肿瘤的发生发展中扮演重要角色，可作为新的肿瘤分子研究靶标。有研究显示，miR-146b-5p在OS中过表达可显著抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，但miR-146b-5p在OS细胞增殖中的相关分子机制尚在探索阶段。故本研究通过体外细胞试验拟探究miR-146b-5p在OS中的表达与其对OS细胞增殖和克隆形成的影响及相关分子机制，以期为OS的临床诊治提供新的研究靶标。

1 材料与方法

1.1 研究对象 人骨肉瘤细胞U2OS细胞购于中国科学院上海细胞库，培养在含10g/dl胎牛血清DMEM培养基中，加入青霉素100 IU/ml和链霉素100 µg/ml，在37℃，5ml/dl CO2培养箱中培养。选取2018年1月～2020年12月内蒙古自治区巴彦淖尔市医院病理科留存的30例骨肉瘤组织及对应正常组织样品，均经病理确认为骨肉瘤，术前未行任何相关治疗，组织样本来源于手术获取，低温液氮保存备用。

1.2 仪器及试剂 DMEM培养液（美国HyClone公司）；链霉素、青霉素、胰酶（美国Gibco公司）；Lipofectamine 2000（北京优尼康生物科技有限公司）；酶标仪（瑞士Tecan公司）；MTS细胞增殖检测试剂盒、克隆形成检测试剂盒（美国corning公司）；PCR仪（美国ABI公司）；逆转录试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；双荧光素酶测定系统（北京Promega公司）；蛋白免疫印迹实验电泳仪、转膜槽（美国Bio-Rad公司），DUSP16抗体（美国SigmaAldrich公司）；miR-146b-5p引物 序 列，miR-146b-5p mimics，miR-146b-5p ASO（反义核酸）及siRNA-DUSP16和无义序列siCTL由上海吉玛生物制药有限公司设计合成；DUSP16-3’UTR-WT野生型质粒和DUSP16-3’UTR-MUT突变型质粒报告基因载体（美国Promega公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及分组：待细胞生长密度达80%左右时，按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将NC-mimics，miR-146b-5p mimics，NC-ASO，miR-146b-5p-ASO及siRNA-DUSP16和siCTL分别转染至U2OS细胞，设为miR-146b-5p阴性过表达组（NC-mimics组），miR-146b-5p过表达组（miR-146b-5p mimics组）和miR-146b-5p阴性抑制组（NC-ASO），miR-146b-5p抑制组（miR-146b-5p-ASO组）及DUSP16敲低表达组（shDUSP16），DUSP16对照组（siCTL组）；更换DMEM培养液培养48 h，qRT-PCR验证转染效率。

1.3.2 实时荧光定量PCR实验（qRT-PCR）：取转染后各组细胞采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，反转录为cDNA，以此为模板配置RCR反应体系行RT-PCR扩增分析。miR-146b-5p引物序列：上 游5’- CGTGCCACTGACAAGTGAAT-3’,下 游5’-CGACCAGAACTCAGTCGACA-3’；内参GAPDH上 游5’- GTCACAGCATTTGCTCGTATTG-3’,下 游5’-CTCCTGCAACATCGTGATCGG-3’；反应条件:95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达。试验重复三次取平均值。

1.3.3 细胞增殖实验：取对数生长期各组细胞以1×107个/孔接种于96孔板，每孔设3个生物复孔，37 ℃，5ml/dl CO2孵育待细胞贴壁后进行转染；配制MTS反应液，每孔加入MTS液 100 μl，继续培养48 h，在490 nm处测量各孔吸光度值（A值），绘制细胞生长曲线，试验重复三次取平均值。

1.3.4 克隆形成实验：待各组细胞贴壁后进行转染，每孔设3个生物复孔，培养至出现肉眼可见的克隆时，终止培养，收集细胞，PBS洗涤两次，去除多余洗涤液，用含0.5g/dl结晶紫的甲醇溶液固定15 min，水洗、晾干，Giemsa染色30 min，在590 nm处测A值，试验重复三次取平均值。

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验：将转染后各组细胞接种到6孔板，待其生长密度为90%时将含有海肾荧光素酶的DUSP16-3’UTR-WT野生型和DUSP16-3’UTR-MUT突变型质粒及miR-146b-5p转染到细胞中，采用双荧光素酶测定系统进行荧光素酶活性测定，试验重复三次取平均值。

1.3.6 蛋白免疫印迹实验：取对数生长期各组细胞加入裂解液提取总蛋白，并测定其浓度及纯度；取定量蛋白制样，SDS-PAGE电泳，转膜，5g/dl脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜；洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h，洗膜3次，化学发光，暗房显影，凝胶成像系统拍照分析。

1.3.7 miR-146b-5p靶标预测：通过microRNA网站进行预测miR-146b-5p与DUSP16的结合位点，行进一步研究。

1.3.8 DUSP16与骨肉瘤预后的相关性：通过公共osteosarcoma R2数据库http://r2.amc分析DUSP16与骨肉瘤预后的关系。

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，两组间差异比较采用t检验；多组间差异比较采用oneway ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验；骨肉瘤组织及其对应正常组织中表达差异比较采用配对t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤中miR-146b-5p表达 见图1。qRTPCR检测显示，30组骨肉瘤组织中miR-146b-5p表达（4.096±1.237）较邻近正常组织（5.895±0.834）显著降低，差异有统计学意义（t=6.605，P＜0.001）。

图1 miR-146b-5p在骨肉瘤组织及邻近正常组织中的表达

2.2 过表达和敲低miR-146b-5p效率验证 qRTPCR检测显示，转染miR-146b-5p mimics组细胞中miR-146b-5p表达（4.562±0.026）较NC-mimics组（1.003±0.002）明显升高，差异有统计学意义（t=236.393，P＜0.001）；转染miR-146b-5p-ASO组细胞中miR-146b-5p表达（0.394±0.002）较NCASO组（1.251±0.003）明显降低，差异有统计学意义（t=411.689，P＜0.001），表明过表达和敲低miR-146b-5p表达的骨肉瘤细胞系构建成功，可用于后续实验。

2.3 miR-146b-5p对骨肉瘤细胞增殖及克隆形成的影响 见表1。增殖实验检测显示，miR-146b-5p过表达明显抑制了骨肉瘤细胞的增殖能力（t=13.233～34.599，均P＜0.01），敲低miR-146b-5p表达则显著促进了骨肉瘤细胞的增殖（t=7.610～9.247，均P＜0.01），差异均有统计学意义。细胞克隆实验检测显示，miR-146b-5p mimics组细胞克隆形成率（48.912±2.032）较NCmimics组（160.834±9.031）明显降低，差异有统计学意义（t=20.942，P＜0.001）；miR-146b-5p-ASO组细胞克隆形成率（239.658±11.034）较NCASO组（128.502±2.413）明显升高，差异有统计学意义（t=17.046，P＜0.001）。

表1 过表达和敲低miR-146b-5p对骨肉瘤细胞增殖的影响（A值，± s）

表1 过表达和敲低miR-146b-5p对骨肉瘤细胞增殖的影响（A值，± s）

时间 NC-mimics组 miR-146b-5p mimics组 t P NC-ASO组 miR-146b-5p-ASO组 t P第1天 0.153±0.003 0.152±0.006 0.258 0.808 0.152±0.004 0.153±0.005 0.271 0.800第2天 0.262±0.002 0.199±0.008 13.233 0.000 0.273±0.004 0.349±0.016 7.982 0.001第3天 0.382±0.006 0.248±0.003 34.599 ＜0.001 0.381±0.008 0.458±0.012 9.247 0.001第4天 0.459±0.015 0.297±0.013 14.136 0.000 0.457±0.017 0.554±0.013 7.851 0.001第5天 0.495±0.013 0.318±0.015 15.445 0.000 0.496±0.021 0.612±0.016 7.610 0.002

2.4 miR-146b-5p靶基因的预测验证及调控关系见图2。 检索microRNA网站发现，miR-146b-5p与DUSP16 3’UTR区域存在靶向结合位点（图2a）。研究将DUSP16-3’UTR-WT和DUSP16-3’UTRMUT质粒载体及miR-146b-5p 共转染至U2OS细胞，经双荧光素酶实验验证显示，转染miR-146b-5p mimics组DUSP16-3’UTR-WT荧光素酶活性（0.394±0.002）较NC-mimics组（1.001±0.002）显著降低，差异有统计学意义（t=371.710，P＜0.001）；而DUSP16-3’UTR-MUT荧光素酶活性（0.998±0.003）较NC-mimics组（1.001±0.001）无显著改变，差异无统计学意义（t=1.643，P=0.176）（图2b），证实DUSP16是miR-146b-5p的潜在靶基因。进一步发现，miR-146b-5p mimics组细胞中DUSP16表达（0.231±0.013）较NC-mimics组（1.011±0.002）明显降低，差异有统计学意义（t=102.715，P＜0.001），相反的miR-146b-5p-ASO组细胞中DUSP16表达（3.264±0.026）较NC-ASO组（1.009±0.003）明显升高，差异有统计学意义（t=149.232，P＜0.001），说明miR-146b-5p负向调控DUSP16表达。

图2 miR-146b-5p靶基因的预测及验证

2.5 DUSP16在骨肉瘤中的表达特征及miR-146b-5p与DUSP16的调控关系验证 见图3，表2。30组骨肉瘤组织中DUSP16表达（5.683±0.457）相比邻近正常组织（4.665±0.531）显著高表达，差异有统计学意义（t=7.959，P＜0.001），与miR-146b-5p在骨肉瘤中的表达呈显著负相关（r=-0.667，P＜0.05）；通过osteosarcoma R2数据库http://r2.amc分析发现DUSP16具有明显的高表达预后差特征（图3a）。细胞增殖实验证实，过表达miR-146b-5p显著抑制细胞增殖，在miR-146b-5p mimics组细胞中过表达DUSP16后细胞增殖速率回归到正常水平，在NC-mimics组中过表达DUSP16后细胞增殖速率较之前明显升高（图3b，表2），说明miR-146b-5p通过负调控DUSP16表达在骨肉瘤细胞中发挥功能。

表2 miR-146b-5p调控DUSP16对细胞增殖的影响（A值，±s）

表2 miR-146b-5p调控DUSP16对细胞增殖的影响（A值，±s）

注：*与NC-mimics组相比，t=13.338, 33.359, 60.381, 96.851; 12.568, 32.564, 59.051, 95.763; 22.059, 28.593, 33.250, 63.479, 均P＜0.001；#与miR-146b-5p-mimics组相比，t=12.825, 33.359, 11.172, 97.214, 均P＜0.001。

时间 NC-mimics组 miR-146b-5pmimics组miR-146b-5pmimics+vector组miR-146b-5pmimics+DUSP16组NC-mimics+DUSP16组 F P第1天 0.177±0.001 0.174±0.003 0.172±0.001 0.175±0.002 0.174±0.002 2.605 0.100第2天 0.298±0.002 0.246±0.004* 0.249±0.003 0.296±0.002# 0.384±0.009* 409.447 ＜0.001第3天 0.401±0.002 0.275±0.003* 0.278±0.002 0.401±0.003# 0.509±0.009* 1356.056 ＜0.001第4天 0.523±0.003 0.296±0.004* 0.301±0.001 0.254±0.004# 0.398±0.008* 1651.033 ＜0.001第5天 0.566±0.002 0.299±0.003* 0.302±0.002 0.567±0.002# 0.741±0.006* 2631.974 ＜0.001

图3 骨肉瘤中DUSP16表达特征及其与miR-146b-5p的调控关系验证

2.6 miR-146b-5p调控DUSP16参与P53信号通路在骨肉瘤中发挥作用 见图4。研究经介导转染siRNA敲低DUSP16表达，发现siDUSP16组P53磷酸化水平（1.342±0.019）较转染无义序列siCTL组（0.452±0.013）显著升高（t=66.960，P＜0.001），同时P53靶基因P21（肿瘤抑制子）表达（3.136±0.145）也较siCTL组（1.110±0.014）显著升高（t=24.089，P＜0.001），差异均有统计学意义（图4a），说明在骨肉瘤中DUSP16可参与调控P53信号通路。进一步验证发现，miR-146b-5p mimics组细胞中P21表达（4.995±0.214）较NC-mimics组（1.001±0.002）显著升高（t=32.325，P＜0.001）；在过表达miR-146b-5p组细胞中再次过表达DUSP16后，P21表达（0.986±0.012）较单独过表达miR-146b-5p组显著降低（t=32.398，P＜0.001）（图4b），差异均有统计学意义。由此说明miR-146b-5p通过靶向调控DUSP16表达在骨肉瘤中发挥作用是通过P53信号通路来实现的。

图4 miR-146b-5p调控DUSP16参与P53信号通路在骨肉瘤中发挥作用

3 讨论

骨肉瘤（OS）占儿童恶性肿瘤的2.4%，恶性程度高，易侵犯周围软组织，常发生远处转移至肺及骨骼等部位，约10%～20% OS患者诊断时已发生早期转移，预后明显恶性[13]。且据报道，非转移性OS患者5年生存率可达80.5%，转移性OS患者5年生存率仅为15%～30%[14]。故基于分子生物学角度探究OS发生、转移的分子机制，找寻新的有效的OS治疗靶标对提高患者预后意义显著。

近年研究发现miRNA可通过碱基互补方式与靶基因3’-UTR区结合，降解mRNA或抑制mRNA翻译，在肿瘤发生发展过程中调节细胞多种生物学过程，参与肿瘤的恶性发展[15,6,8]。miRNAs表达失调是肿瘤发生及转移的诱因[8]。大量研究证实，不同miRNAs异常表达与OS细胞增殖、迁移和侵袭及不良预后相关，如miRNA-505，miR-210-5p和microRNA-320a等[16-18]，由此可见mRNAs在OS中的发生及转移中起着重要作用。miR-146b是近年研究新发现的一种miRNA，位于第10号染色体，包含miR-146b-3p和miR-146b-5p两种形式，其中后者在人肝脏、脾脏组织中呈不同程度高表达[12]。而在肿瘤的研究中发现，miR-146b-5p缺失通过IL-17A途径能够促进T细胞急性淋巴细胞白血病的迁移和侵袭[19]。通过碘参与下调miR-146b-5p可抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖[10]。lnc-AL445665.1-4可能通过与miR-146b-5p的相互作用参与了子宫多发平滑肌瘤的发生发展[11]。lncRNA-NEAT1通过miR-146b-5p/NOTCH1信号通路促进了T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)细胞的增殖[20]。此外还发现，miR-146b-5p在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等人类恶性肿瘤中表达下调[21]，提示其可能作为抑癌基因发挥作用，参与恶性肿瘤的发展进程，可作为肿瘤治疗的新靶点。本研究显示，骨肉瘤组织中miR-146b-5p显著低表达，其过表达能够抑制OS细胞的增殖和克隆形成，发挥抑癌基因特性，故探究其发挥作用的分子机制意义重大。

本研究检索生物学信息数据库发现miR-146b-5p与DUSP16存在结合位点，经荧光素酶实验证实DUSP16是miR-146b-5p的靶基因。研究表明，双重特异性磷酸酶16（DUSP16，也称为促分裂原活化的蛋白激酶磷酸酶7）通过减弱磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基（例如p38和JNK途径21）的磷酸化可抑制其靶激酶的活化[22]。DUSP16表达调节能够控制ERK和p38 MAP激酶活性，介导化疗诱导的乳腺癌干细胞富集[23]。靶向DUSP16/TAK1信号通过抑制JNK MAPK减轻高脂饮食(HFD)小鼠的肝脏血脂异常和炎症[24]。并发现DUSP16表达上调可促进人类肝癌细胞的增殖[25]。CircDUSP16通过调控miR-497-5p/TKTL1轴促进食管鳞癌细胞发育[26]。CircDUSP16通过海绵化miR-145-5p促进了胃癌的发生和侵袭[27]。而本研究中发现骨肉瘤组织中DUSP16显著高表达，具有明显的高表达预后差特征，与miR-146b-5p存在显著负相关，暗示了DUSP16的癌基因属性。经细胞实验检测证实， DUSP16过表达促进了OS细胞增殖，miR-146b-5p对OS细胞的增殖调控与其对DUSP16表达的调控相关。作用机制方面，既往研究报道在三阴性乳腺癌化疗过程中，DUSP16 表达显著降低导致p38被激活，从而促进了化疗耐药乳腺癌干细胞表型的规范，为临床治疗提供了新靶点[23]。既往HAO等[28]也报道，小鼠模型中DUSP1可抑制p38 MAPK磷酸化，导致HCC细胞中P53磷酸化增强，从而激活p53和p21并诱导其表达，促进肝细胞癌细胞的凋亡。所以本研究进一步探究了miR-146b-5p调控DUSP16对P53信号通路的影响，发现敲低DUSP16可促使P53磷酸化及P53靶基因P21表达显著升高，证实miR-146b-5p调控DUSP16可能通过P53信号通路参与了OS的发生发展。故继续探究miR-146b-5p调控DUSP16对P53信号通路的影响机制可为OS的诊断及治疗提供更加有效的参考靶标。

综上所述，OS中miR-146b-5p低表达通过靶向负调控DUSP16参与OS细胞的增殖及克隆形成，与P53信号通路关系密切。