血管内皮功能调节酶pCDH-Myc-UBR5分子克隆的构建

赵海静，刘琪，金蕊，程龙，刘昱圻，陈韵岱*

(1解放军医学院，北京 100853；2中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生物工程研究所，北京 100071；3中国人民解放军总医院第六医学中心心血管病医学部，北京 100048)

泛素蛋白连接酶E3组分N-识别蛋白5(ubi-quitin protein ligase E3 component N-recognin 5，UBR5)是果蝇增生盘的哺乳动物同源基因[1]，与细胞增殖、衰老及肿瘤的产生相关。UBR5参与细胞周期的调控，具有介导核糖体RNA成熟[2]、响应DNA损伤反应[3]等功能。以往的研究多聚焦在UBR5与肿瘤的相关性上，UBR5通过调控经典Wnt信号通路，以糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)依赖的方式泛素化β-连环蛋白(β-catenin)并上调其表达水平[4]。UBR5在乳腺癌、胰腺癌细胞中高表达[5]，并能促进胰腺癌、黑色素瘤等肿瘤的增殖和转移[6,7]。

近期研究发现，UBR5在心血管系统中发挥重要作用。UBR5能够促进DNA的修复并维持内皮细胞的稳态[8]，减轻线粒体DNA的损伤，并且能够改善血管祖细胞的功能[9]，促进受损内皮细胞的修复。有报道UBR5-/-小鼠存在血管缺陷，并且发现在小鼠中动脉损伤可引起UBR5表达水平的降低[10]。因此UBR5可能与冠心病等心血管疾病的发生及发展相关。为进一步探究UBR5在内皮细胞稳态及心血管疾病中的作用，我们构建了人UBR5基因的真核表达质粒，利用人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cells 293 SV40 LT，HEK293T)鉴定UBR5蛋白的表达，并证实了UBR5与血管生成调控蛋白先天性角化不良1(dyskeratosis congenita 1，DKC1)存在相互作用，为探究UBR5在心血管系统的生物学功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

克隆重组载体pCDH-EF1-Myc-puro(pCDH-Myc)、pCDH-Flag-DKC1质粒、HEK293T细胞、人乳腺癌细胞(Michigan cancer foundation-7，MCF7)为军事医学科学院生物工程研究所惠赠；高保真DNA聚合酶购自宝日医生物技术有限公司；限制性核酸内切酶(BamHⅠ及NotⅠ)购自美国纽英伦生物技术有限公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的引物合成及基因测序委托北京博迈德公司完成。化学发光仪购自美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MCF7细胞及HEK293T细胞培养在含有10% 胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)的改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)中，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中。当细胞约80%融合时1∶5传代。

1.2.2 获取目的基因 采用细胞总RNA提取剂提取MCF7细胞的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，反转录为互补DNA(complementary DNA，cDNA)。反转录第一步：5×基因组DNA清除缓冲液(5×gDNA eraser buffer)2 μl、基因组DNA清除剂(gDNA eraser)1 μl、mRNA模板≤1 μg、二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水补至10 μl，42 ℃ 2 min。反转录第二步：反转录引物混合物1 μl、5×反转录缓冲液4 μl、反转录酶混合物1μl、DEPC水 4 μl，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冷却至4℃，获得cDNA模板。

根据目的基因UBR5编码区序列设计扩增引物。因UBR5编码区长达8 397 bp，直接扩增难度较大，成功率较低，所以在4 566-4 587位碱基处将UBR5编码区分为前后两个片段分别扩增。两基因片段进行PCR扩增的上下游引物分别为上游引物1(forward primer 1，F1)：5′-ATTTGTTAAGAAAGAGA-

GGATCCACGTCCATCCATTTCGTG-3′；下游引物1(reverse primer 1，R1)：5′-TGCTGATTGAGGTATACTTGCT-3′；上游引物2(forward primer 2，F2)：5′-GCAAGTATACCTCAATCAGCA-3′；下游引物2(reverse primer 2，R2)：5′-CTGCCCTCAGCGGCCGCCACAAAACCAAAATTCTTGGTCT-3′，其中片段1的下游引物R1与片段2的上游引物F2重叠互补，作为两片段同源臂用以重组连接。分别以MCF7细胞的cDNA为模板， F1、R1及F2、R2为引物进行PCR扩增UBR5目的基因，条件为：95 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，54 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.5 min，29个循环；68 ℃ 10 min，冷却至4 ℃。使用0.7%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，并回收目的条带。

1.2.3 构建pCDH-Myc-UBR5重组质粒 使用限制性核酸内切酶BamHⅠ及NotⅠ将pCDH-Myc载体双酶切。体系：10×酶切缓冲液5 μl、内切酶各1.5 μl、质粒1～2 μg、双蒸水补至50 μl，37 ℃孵育5 h。酶切产物及目的基因使用琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的条带。载体与目的基因重组(摩尔比1∶1)，体系为：2×克隆重组混合物5 μl，双蒸水补至10 μl，50 ℃连接60 min。连接产物转化至感受态细菌，37 ℃过夜培养。挑取多个单克隆菌落，通过菌液PCR及质粒酶切鉴定阳性克隆，并将阳性克隆送公司测序。

1.2.4 蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定Myc-UBR5蛋白表达 HEK293T细胞转染质粒pCDH-Myc-UBR5或pCDH-Myc(空白对照)。细胞样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳、湿转、封闭后，使用Myc-辣根过氧化物酶(Myc-horseradish peroxidase，Myc-HRP)抗体(1∶3 000)于4 ℃摇床孵育过夜，显影。

1.2.5 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)实验 HEK293T细胞对照组转染质粒pCDH-Flag-DKC1、pCDH-Myc，实验组转染质粒pCDH-Flag-DKC1、pCDH-Myc-UBR5。使用免疫共沉淀缓冲液裂解细胞样品。免疫共沉淀缓冲液配方如下：50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(pH值7.4)、1%聚乙二醇辛基苯基醚、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸溶液、150 mmol/L氯化钠溶液、10%甘油、40 mmol/L β-巯基乙醇。样品冰上裂解30 min，加入抗-Flag磁珠4 ℃孵育过夜。样品SDS-PAGE电泳，经湿转、封闭后，使用Myc-HRP抗体(1∶3000)及Flag-辣根过氧化物酶(Flag-horseradish peroxidase，Flag-HRP)抗体(1∶5 000)4 ℃摇床孵育过夜，显影。

2 结 果

2.1 pCDH-Myc-UBR5重组质粒构建及鉴定

为鉴定pCDH-Myc-UBR5重组质粒是否构建成功，将两段目的片段与线性pCDH-Myc载体连接重组，转化至感受态细胞，对单克隆菌落行菌液PCR及酶切鉴定，将阳性克隆送公司测序。UBR5基因编码区序列分为前后两段分别扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，在4 118 bp及4 295 bp处产生特异性条带，与预期目的片段大小一致(图1A)。使用F1、R1引物进行菌液PCR扩增，阳性菌落在4 118 bp处出现特异性条带(图1B)。阳性菌液提取质粒并经BamHⅠ、NotⅠ双酶切，出现两条特异性条带，与目的基因和载体大小相同，约为8 397 bp、7 095 bp(图1C)。

将菌液PCR及酶切鉴定均阳性的菌落进行基因测序，测序结果与UBR5序列比对一致(图1D)，证明UBR5正确插入到pCDH-Myc载体中。

图1 pCDH-Myc-UBR5重组质粒构建及鉴定Figure 1 Construction and identification of pCDH-Myc-UBR5 recombinant plasmidA: gel electrophoresis of UBR5 gene PCR products. The UBR5 sequence was amplified into two fragments (fragment 1 of UBR5 and fragment 2 of UBR5), and the amplified products were identified by gel electrophoresis. B: gel electrophoresis of pCDH-Myc-UBR5 bacteria liquid PCR products.‘1-5′ were selected as the clone colonies, and ‘5′ were identified as positive colony. C: endonuclease identification of pCDH-Myc-UBR5. 1, recombinant plasmid pCDH-Myc-UBR5 after double enzyme digestion; 2, recombinant plasmid pCDH-Myc-UBR5 without enzyme digestion. D: pCDH-Myc-UBR5 partial sequence, after DNA sequencing. pCDH-Myc-UBR5: pCDH-EF1-Myc-puro-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; PCR: polymerase chain reaction; M: DNA marker DL15000.

2.2 Western blotting鉴定Myc-UBR5蛋白表达

为验证pCDH-Myc-UBR5重组质粒能否在细胞内正确表达，将其转染至HEK293T细胞中，Western blotting鉴定Myc-UBR5蛋白表达情况。与对照组相比，转染pCDH-Myc-UBR5质粒的细胞在约309 ku处出现特异条带(图2)。

图2 Myc-UBR5蛋白表达鉴定Figure 2 Expression of Myc-UBR5Myc-UBR5: Myc-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; pCDH-Myc: pCDH-EF1-Myc-puro; pCDH-Myc-UBR5: pCDH-EF1-Myc-puro-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5.

2.3 Co-IP检测UBR5与DKCI的相互作用

UBR5与H/ACA核糖核蛋白复合物(H/ACA ribonucleoprotein complex，H/ACA RNP)存在相互作用[2]。为验证Myc-UBR5与H/ACA RNP复合物催化蛋白DKC1存在相互作用，HEK293T细胞同时转染pCDH-Myc-UBR5及pCDH-Flag-DKC1，经Co-IP实验表明Myc-UBR5与Flag-DKC1在细胞内可能存在相互作用(图3)。

图3 UBR5与DKC1存在相互作用Figure 3 Interaction between UBR5 and DKC1HEK293T cells transfected with pCDH-Myc-UBR5 and pCDH-Flag-DKC1, and immunoprecipitated with anti-Myc beads. Western blotting was performed using anti-Myc and anti-Flag antibodies. UBR5: ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; DKC1: dys-keratosis congenita 1; HEK293T: human embryonic kidney cells 293 SV40 LT. IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting; pCDH-Myc: pCDH-EF1-Myc-puro; pCDH-Myc-UBR5: pCDH-EF1-Myc-puro-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; pCDH-Flag-DKC1: pCDH-EF1-Flag-puro-dyskeratosis congenita 1.

3 讨 论

泛素-蛋白酶体系统是参与细胞信号传导且具有高度选择性的蛋白质降解途径，是最为广泛的蛋白质翻译后修饰方式之一。作为蛋白质稳态调节剂[11]，泛素化系统在维持细胞正常生理功能中有着至关重要的地位。UBR5属于E6AP C末端同源(homologous to E6AP C terminus，HECT)E3泛素连接酶，主要负责识别特异性底物和泛素链拓扑结构[12]，能识别N-端规则通路[13,14]，与心脏发育、血管生成、DNA修复、减数分裂、神经发育等相关。UBR5在胚胎干细胞中高表达，其表达量随细胞分化而降低[15]。UBR5参与维持DNA损伤后的泛素信号稳态，可调控DNA损伤检查点激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2)的活性，参与细胞周期中DNA合成前期/DNA复制期(G1/S期)及DNA复制期(S期)DNA损伤检查点的激活，及双链DNA断裂后DNA合成后期/细胞分裂期(G2/M期)的阻滞[16]，间接调节磷酸化H2A.X变体组蛋白(γH2A. X variant histone，γH2AX)的泛素化[17]，促进DNA双链断裂位点的修复，从而维持基因组稳定。此外，UBR5还参与细胞的糖异生过程。高糖通过刺激磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PEPCK1)的乙酰化加强其与UBR5 HECT结构域的相互作用，从而促进PEPCK1的泛素化降解和细胞糖异生过程[18]。

随着研究的深入，UBR5与心血管系统的相关证据逐渐浮出水面。UBR5通过修复DNA损伤维持内皮细胞稳态。Li等[8]发现肺动脉高压患者的肺动脉内皮细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)与UBR5的相互作用中断，DNA损伤且内皮细胞稳态丧失。UBR5与DNA损伤感应子存在相互作用[19]，可响应内皮细胞的DNA损伤反应。PPARγ/UBR5通路的激活能够抑制线粒体DNA损伤，改善内皮祖细胞功能[9]。此外，UBR5还能结合并稳定转录共激活因子心肌素，上调平滑肌特异性基因的转录，在血管发育中起关键作用[10]。然而，UBR5在维持内皮细胞稳态、调节血管功能及心血管相关疾病中发挥的作用仍不明确。

本实验通过Co-IP发现UBR5与血管生成调节蛋白DKC1存在相互作用。DKC1可能通过直接激活缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的转录促进血管生成[20]。转录因子HIF-1α由缺氧激活，表达水平受氧浓度调控，并可以诱导下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。HIF-1α可以改善急性心肌梗死大鼠的心功能，提高心脏毛细血管密度[21]。DKC1增强HIF-1α的转录，靶向内皮细胞生长因子促进血管生成，改善心肌重构及心脏功能。目前UBR5调控内皮细胞稳态，促进平滑肌细胞分化及参与血管生成方面的功能仍需后续实验进一步研究。

本研究通过PCR技术克隆UBR5编码区序列，经菌液PCR、酶切及测序鉴定，成功将UBR5插入到pCDH-Myc载体中。将pCDH-Myc-UBR5瞬转至HEK293T细胞中，证实Myc-UBR5在细胞中成功表达。重组质粒具有生物学功能，Co-IP证实UBR5与血管生成调控蛋白DKC1存在相互作用，为下一步研究UBR5在心血管系统的功能奠定了基础。