基于HPLC指纹图谱研究和多成分含量测定的尖叶假龙胆药材的质量评价研究*

河北中医学院

张 闯 刘卫哲 董倩波△ 刘兴超 杨洪霞 孙佳欢 李 斯 李爱英(石家庄 050091)

提要 目的：建立尖叶假龙胆高效液相色谱法(HPLC)指纹图谱并同时测定其中8种成分含量测定方法。方法：本方法采用HPLC，色谱柱为Waters XBridge C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，体积流量为1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长为254 nm，同时测定18批尖叶假龙胆组指纹图谱及8种成分含量。结果：18批尖叶假龙胆指纹图谱相似度大于0.990，标定了20个共有峰并测定了8种成分含量。结论：多成分含量测定方法以及指纹图谱方法准确、稳定、重复性好，可为尖叶假龙胆质量控制标准的建立提供依据。

中药指纹图谱可以体现药材中已知成分或未知成分的分布情况，具有整体性、特征性等特点，能够较为全面地反映中药所含化学成分的相对关系，同时提供丰富的鉴别信息，真正全面地表征药材内在质量[19-21]。

本实验建立尖叶假龙胆高效液相色谱法(HPLC)指纹图谱，同时测定尖叶假龙胆中8种活性成分的含量，以期完善尖叶假龙胆的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)、UV-9000紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)、SQP型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、Milli-Q超纯水机(美国密理博公司)。

1.2 试剂 龙胆苦苷(批号：J0316AS)、芒果苷(批号：N0213AS)对照品购自大连美仑生物技术有限公司，异牡荆素(批号：No.524B021)、木犀草素(批号：4773-96-0)对照品购自北京索莱宝科技有限公司，去甲基雏菊叶龙胆酮(批号：Z08M8S30830)、雏菊叶龙胆酮(批号：Z10M8B30943)对照品，均购于南京元宝峰医药科技有限公司，去甲当药醇苷和当药醇苷由实验室自制，各对照品质量分数均≥98%，可供含量测定用。乙腈(色谱纯，Fisher公司)，超纯水为实验室Milli-Q超纯水机自制。

1.3 药材 药材样品于2014年至2019年在内蒙古、黑龙江、宁夏每年采集1次，共18批，经河北中医学院药学院中药鉴定与炮制教研室鉴定为龙胆科假龙胆属植物尖叶假龙胆(Gentianellaacuta)，样品信息详见表1。

表1 尖叶假龙胆药材样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱( 250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱：0～10 min，5%～5%乙腈；10～20 min，5%～10%乙腈；20～30 min，10%～20%乙腈；30～ 35 min, 20%～30%乙腈；35～45 min，30%～50%乙腈；45～50 min，50%～60%乙腈；50～60 min，60%～60%乙腈；体积流量1.0 mL/min；进样体积10 μL；检测波长254 nm；柱温为35 ℃。

2.2 供试品溶液的制备 取尖叶假龙胆样品适量，精密称取0.10 g，倒入50 mL的具塞锥形瓶中，加入甲醇溶剂50 mL，超声提取30 min，冷却至室温，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取8种标准品适量，加入10 mL量瓶中，用甲醇配制质量分数分别为龙胆苦苷46.40 mg/L、芒果苷45.01 mg/L、去甲当药醇苷15.03 mg/L、异牡荆素63.78 mg/L、当药醇苷55.05 mg/L、木犀草素41.26 mg/L、去甲基雏菊叶龙胆酮36.30 mg/L和雏菊叶龙胆酮38.80 mg/L混合对照品溶液，摇匀，放于4 ℃冰箱中保存，以备使用。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 精密度试验：取尖叶假龙胆供试品溶液(S1)，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以分离度较好且峰面积较大的雏菊叶龙胆酮色谱峰峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间的RSD<2.21%，相对峰面积的RSD<1.78%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验：取尖叶假龙胆供试品溶液(S1)，并按“2.1”项下色谱条件连续进样，记录6份尖叶假龙胆样品色谱图，以雏菊叶龙胆酮色谱峰峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间的RSD<2.15%，相对峰面积的RSD<1.89%，表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验：取尖叶假龙胆供试品溶液(S1)，分别在制备后的0、2、4、8、12、24、48 h按“2.1”项下色谱条件进样，以雏菊叶龙胆酮色谱峰峰面积为参照，计算相对保留时间的RSD<2.07%，相对峰面积的RSD<1.66%，说明供试品溶液在48 h内稳定。

2.4.4 尖叶假龙胆指纹图谱的建立及相似度评价：取收集的18批尖叶假龙胆，按“2.2”项下样品处理方法制备尖叶假龙胆供试品溶液(S1～S18)，并按“2.1”项下色谱条件依次进样检测。将所得18批样品的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”进行分析，以S1为参照图谱，多点校正后进行自动匹配，用中位数法生成对照指纹图谱，得到尖叶假龙胆指纹图谱共有模式及对照指纹图谱，结果见图1。经匹配后标定了尖叶假龙胆样品指纹图谱中20个共有峰，各共有峰相对保留时间的RSD<2.0%，以生成的尖叶假龙胆对照指纹图谱为参照，对18批尖叶假龙胆色谱图进行相似度评价，S1～S18相似度均≥0.990。

图1 18批尖叶假龙胆的HPLC指纹图谱叠加图

2.4.5 指纹图谱共有峰的指认与归属：通过与混合对照品比对，确定20个共有峰中，4号峰为龙胆苦苷，5号峰为芒果苷，8号峰为去甲当药醇苷，10号峰为异牡荆素，13号峰为当药醇苷，15号峰为木犀草素，17号峰为去甲基雏菊叶龙胆酮，20号峰为雏菊叶龙胆酮，混合对照品及尖叶假龙胆样品的HPLC色谱图见图1。

2.5 尖叶假龙胆中8种成分含量测定

2.5.1 色谱条件及供试品溶液、混合对照品溶液的制备：同“2.1”“2.2”“2.3”项下方法。尖叶假龙胆8种混合对照品与药材色谱图见图2。

注：1.龙胆苦苷;2.芒果苷;3.去甲当药醇苷;4.异牡荆素;5.当药醇;6.木犀草素;7.去甲基雏菊叶龙胆酮;8.雏菊叶龙胆酮。图2 尖叶假龙胆混合对照品(A)和尖叶假龙胆样品(B)的HPLC色谱图

2.5.2 线性关系考察：按“2.3”项下方法制备的龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮的混合对照品溶液，作为标准曲线最高质量浓度。按照倍比稀释法，制备不同质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。分别以龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮的质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到8种对照品的回归方程和相关系数，结果详见表2。结果表明龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮在相应的质量浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

表2 8种成分线性关系考察结果 (mg/L)

2.5.3 精密度试验：取尖叶假龙胆供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得到龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮面积的RSD值分别为0.12%、0.45%、1.37%、0.91%、1.46%、0.83%、0.51%、0.79%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验：取同一批尖叶假龙胆供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件连续进样，计算得到龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮质量分数的RSD值分别为0.77%、1.01%、0.88%、1.83%、0.59%、1.40%、0.91%、1.20%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验：取尖叶假龙胆供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、12、24、48 h进样测定，计算得到龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮峰面积的RSD值分别为0.45%、0.62%、1.20%、1.52%、0.62%、1.37%、0.79%、1.07%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验：取同一批尖叶假龙胆样品(S1)0.1 g，精密称定6份，置100 mL量瓶中，分别加入各对照品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算得到龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮的平均加样回收率分别为101.42%、100.66%、101.26%、101.74%、100.59%、99.37%、101.32%、99.90%，RSD值分别为0.93%、0.76%、1.33%、2.36%、1.26%、1.74%、0.84%、1.16%，表明该方法的准确度良好。

2.5.7 样品测定：制备18批尖叶假龙胆样品的供试品溶液(S1～S18)，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中8种成分的含量，结果详见表3。18批尖叶假龙胆中，龙胆苦苷、芒果苷、去甲当药醇苷、异牡荆素、当药醇苷、木犀草素、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮的质量分数分别为1.45～1.68、1.14～1.27、12.88～13.75、0.10～0.13、9.84～10.42、0.44～0.56、12.58～13.03 、15.80～16.98 mg/g，其中去甲当药醇苷、当药醇苷、去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮含量较高，异牡荆素和木犀草素含量较少。

表3 18批尖叶假龙胆药材中8种成分含量 (mg/g, n=3)

3 讨论

综上，本研究采用HPLC法建立了尖叶假龙胆指纹图谱，并同时测定8种成分的含量。该方法简便、准确，有效地反映了尖叶假龙胆的定性特征和定量信息，为其全面质量控制提供了方法。