黄芪中毛蕊异黄酮不同剂量对脑缺血再灌注大鼠神经细胞的保护作用*

河北中医学院/河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室

张彐宁 靳晓飞 张 怡 周晓红 高维娟(石家庄 050091)

提要 目的：研究黄芪中毛蕊异黄酮不同剂量对脑缺血再灌注(CIR)大鼠神经细胞损伤的影响，为临床治疗提供用药依据。方法：将SPF级雄性SD大鼠50只，随机分为：假手术组、模型组、毛蕊异黄酮低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg)。采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，在体模拟CIR损伤环境。利用神经功能学评分(Zea Longa)法初步观察CIR损伤后大鼠神经功能表现；盐酸2,3,5-三苯基四氮(TTC)染色检测脑梗死体积；尼氏染色观察尼氏体变化；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达。结果：与假手术组对比，模型组神经功能缺损症状明显(P<0.05)，脑梗死体积明显增大(P<0.05)，尼氏体明显减少(P<0.05)，凋亡蛋白Caspase-3的表达明显增加(P<0.05)，与模型组对比，给予不同剂量毛蕊异黄酮处理后，可见大鼠神经功能障碍明显改善，脑梗死体积明显减少(P<0.05)；尼氏体明显增多(P<0.05)；凋亡蛋白Caspase-3表达明显降低(P<0.05)；并且在以上检测指标中，以毛蕊异黄酮高剂量组更为显著。结论：黄芪中的毛蕊异黄酮可改善CIR损伤大鼠神经功能障碍，减小脑梗死体积，发挥神经保护作用，而毛蕊异黄酮高剂量组作用更为突出。

脑缺血再灌注(CIR)损伤是指脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的局部脑组织及其功能受损[1]。CIR损伤是缺血性脑卒中的重要并发症。如何有效减轻再灌注造成的伤害，成为临床和科研领域研究的重点。近年来随着医学领域的发展，人们对CIR损伤的发生机制不断深入探索，并且在CIR损伤的治疗过程中愈加重视中医中药的防治作用。补阳还五汤是益气活血法的代表方，又是治疗缺血性脑卒中的常用方，此方证以气虚为本，血瘀为标，治以补气为主，活血通络为辅，方中重用生黄芪为君药，补益元气，意在气旺则血行，瘀去络通，在治疗气虚血瘀型中风中收到显著疗效[2]。现代药理学研究证实，黄芪主要活性成分包括黄芪黄酮、黄芪多糖、黄芪皂苷三大类，毛蕊异黄酮作为黄芪黄酮类主要活性成分，具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒等作用[3]。本课题组前期在细胞水平观察了毛蕊异黄酮对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞(PC12细胞系是来源于成年大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞系)的影响，结果发现毛蕊异黄酮可显著提高PC12细胞活性，减轻PC12细胞损伤，发挥保护作用[4]。本研究意在动物水平探讨毛蕊异黄酮是否具有减轻大鼠CIR注损伤的作用。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠，SPF级，5周龄，50只，雄性，体质量260～280 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。

1.2 试剂 毛蕊异黄酮购自上海士峰生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：18060411；线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)栓线(250～280 g)购自北京西浓科技有限公司(批号：2636-A3)；盐酸2，3，5-三苯基四氮(TTC)染液(批号：T8877)购自美国Sigma公司；半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)单克隆抗体(批号：9662S)购自美国CST公司；BCA 蛋白测定试剂盒(批号：PC0020)购自北京索莱宝科技有限公司；甲苯胺蓝染液(批号：20170227)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器 多功能成像系统购自Vilber公司；LI-360型电热恒温培养箱购自上海龙跃仪器设备有限公司；Axio Observer 7型全自动倒置荧光显微镜购自德国Carl Zeiss公司；EG1150H型组织包埋机、RM2255型切片机购自德国Leica公司。

2 方法

2.1 实验分组与模型制备 SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、毛蕊异黄酮低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg)。采用改良线栓法建立CIR损伤模型：SD大鼠适应性饲养7 d，术前禁食6～8 h，麻醉大鼠采用腹腔注射4%的戊巴比妥钠，使大鼠呈仰卧位固定于动物手术台上，常规颈部备皮消毒，颈部正中切口，玻璃分针钝性分离、暴露颈总、颈内、颈外动脉，结扎并离断颈外动脉，使线栓由颈外经颈总动脉插入到颈内动脉约(18±1)mm处，阻塞大脑中动脉2 h，即缺血2 h，之后缓慢拔出线栓，使颈内动脉和大脑中动脉恢复血流，即再灌注开始，再灌注24 h后，根据神经功能学评分(Zea Longa)标准：在术后24 h及术后苏醒后进行观察评分，0分，无神经系统缺损症状；1 分，不能完全伸展病灶对侧前爪；2分，行走向病灶对侧转圈；3分，行走困难，向病灶对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失；5分，大鼠死亡。0分、4分和5分者剔除，1分、2分、3分者为造模成功，列为实验对象。假手术组线栓只插入到颈内动脉，而不进入大脑中动脉。给药组在再灌注的同时给予腹腔注射不同剂量(5、10、20 mg/kg)的毛蕊异黄酮处理，腹腔注射给药体积为8 mL/kg，假手术组和模型组等体积腹腔注射生理盐水。

2.2 TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积 各组大鼠造模给药完成后，断头取材，将完整脑组织放入脑槽内置于-20 ℃冰箱，冷冻18 min，做冠状位切片，每片脑组织厚度约2 mm，置于2% TTC染液中，放入37 ℃电热恒温培养箱避光孵育30 min，15 min时翻动1次，取出脑切片，按顺序依次摆放，拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析图片并计算脑梗死体积百分比(%)。

2.3 尼氏染色检测各组大鼠尼氏体平均吸光度值 各组大鼠断头取材，做厚度约4 mm冠状切片，进行组织固定、包埋，切片脱蜡至水，加入1%甲苯胺蓝置于55～60 ℃电热恒温培养箱避光孵育30 min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精分化，无水乙醇脱水，二甲苯中透明5 min，中性树胶封片。倒置显微镜下观察并拍照，Image-Pro Plus 6.0 软件分析并计算尼氏体平均吸光度值。

2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠Caspase-3蛋白表达 各组大鼠造模给药处理后，断头取材，每组大鼠选取右侧大脑中动脉供血区脑组织50 mg，进行组织研磨裂解，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将蛋白湿转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Caspase-3抗体4 ℃过夜，等渗缓冲盐溶液(TBST)清洗3次，室温孵育相应二抗1 h，TBST洗去二抗，将PVDF膜置于配制好的ECL化学发光液内，凝胶成像系统扫描成像，采用Image J软件分析，计算目的条带/对应内参的相对表达水平。

3 结果

3.1 Zea Longa法检测各组大鼠神经功能学评分结果 假手术组无神经系统缺损症状，评分为0；与假手术组相比，模型组出现明显的神经功能损伤(P<0.05)；与模型组相比，毛蕊异黄酮中、高剂量组神经功能损伤症状明显减轻(P<0.05)，其中高剂量组最为显著。详见表1。

表1 Zea Longa法检测各组大鼠神经 功能学评分结果

3.2 各组大鼠脑梗死体积的变化 TTC染色结果显示：假手术组脑梗死体积为0，未见梗死灶，其它各组均有不同程度的脑梗死灶形成。与假手术组相比，模型组大鼠可见明显的梗死灶，TTC染色白色缺血区明显，有明显的梗死灶形成(P<0.05)；与模型组相比，毛蕊异黄酮中、高剂量组脑梗死体积均有所减小，其中高剂量组最为显著(P<0.05)。见图1、表2。

注：A，假手术组；B，模型组；C，毛蕊异黄酮低剂量组；D，毛蕊异黄酮中剂量组；E，毛蕊异黄酮高剂量组。图1 TTC染色结果

表1 TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积结果

3.3 各组大鼠尼氏体的变化 尼氏染色显示：假手术组尼氏体丰富，细胞排列整齐，并且细胞形态规则，轮廓清晰，神经细胞数量较多。与假手术组相比，模型组细胞数量较少，细胞皱缩，轮廓模糊不清，尼氏体明显减少，并且平均吸光度值明显降低 (P<0.05) 。与模型组相比，毛蕊异黄酮中、高剂量组细胞状态明显好转，尼氏体增多，尼氏体平均吸光度值明显增加，并且毛蕊异黄酮高剂量组更为显著(P<0.05)。见图2、表3。

注：A，假手术组；B，模型组；C，毛蕊异黄酮低剂量组；D，毛蕊异黄酮中剂量组；E，毛蕊异黄酮高剂量组。图2 尼氏染色结果

表3 尼氏染色检测各组大鼠尼氏体平均吸光度值结果

3.4 各组大鼠脑组织中Caspase-3蛋白表达的变化 Western blot检测结果显示：与假手术组相比，模型组凋亡蛋白Caspase-3的表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，毛蕊异黄酮中、高剂量组Caspase-3的表达明显降低，且以毛蕊异黄酮高剂量组更为显著(P<0.05)。见图3、表4。

图3 Western blot检测结果

表4 Western blot检测各组大鼠Caspase-3相对表达量结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05;与低剂量组比较，△P<0.05。

4 讨论

脑缺血再灌注(CIR)损伤可造成脑功能严重受损，当脑组织由缺血低灌注转变为再灌注时，脑细胞生物电发生改变，产生病理性慢波，伴随着缺血再灌注的发生，病理性慢波持续并加重，出现一系列病理生理改变[5]。主要涉及的病理生理机制包括：炎症反应、钙离子超载、自由基过量生成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞凋亡与自噬等[6-9]。细胞凋亡在CIR病理进程中扮演了重要角色，随着缺血再灌注损伤时间越长，脑组织超微结构开始发生明显改变：线粒体肿胀，钙离子沉积，线粒体嵴断裂、胞核固缩、染色质凝集或边缘化、内质网高度肿胀、尼氏体完整性破坏或消失、细胞结构明显破坏，最终导致神经细胞凋亡[10]。CIR引起的神经细胞死亡方式主要以细胞凋亡为主，发生的部位主要在缺血病灶中心区周围的半暗带区域，而缺血半暗带区常作为临床上治疗CIR损伤的治疗基础。因此，有效抑制细胞凋亡对于减轻CIR损伤具有重要意义。

细胞凋亡(apoptosis)是指生物体为维持自身内环境稳定，由严格基因调控的细胞自主性有序死亡过程。当细胞接收到凋亡信号刺激后，凋亡调控分子间相互作用，产生一系列复杂的生化反应，诱导蛋白水解酶(caspase)活化，从而裂解关键的细胞基质，导致细胞程序性死亡[11]。在此过程中，Bcl-2蛋白(B淋巴细胞瘤-2基因)家族的促凋亡蛋白Bax(Bcl-2-associated X蛋白质)发生寡聚化并向线粒体外膜聚集，从而改变线粒体膜通透性，使细胞色素c等促凋亡分子由线粒体膜间隙释放入细胞质，激活内在的凋亡级联反应，导致Caspase-3激活，最终诱导细胞凋亡[12]。Caspase-3蛋白在细胞凋亡程序中是最主要的终末剪切酶，在包括神经元在内的许多细胞类型中充当凋亡的执行者[13]，抑制Caspase-3活化，可阻止细胞凋亡的发生[14]，在细胞凋亡机制的研究中常作为重要参考指标。

中药黄芪是临床常用补气要药，始载于《神农本草经》，具有补气活血化瘀之功效。中医理论中气与血之间有着紧密的联系，“气为血之帅”“血为气之母”“气能生血”“气能行血”“气行则血行”等理论更是阐述了气血之间的具体关系，在缺血性脑中风的治疗过程中，常以黄芪配伍成方，治疗中风之气虚血瘀证。补阳还五汤即为治疗气虚血瘀型中风的代表方剂，在临床上应用至今，并取得显著疗效[15-16]。现代药理学研究发现，黄芪的主要活性成分包括黄酮、皂苷、多糖三大类成分[17]，在调控自噬、抗炎、抗氧化、促进干细胞增值、调节血压、改善认知功能障碍等方面均发挥着重要作用。其中，黄芪黄酮类成分更是受到越来越多的关注，毛蕊异黄酮是黄酮类的主要活性成分之一，亦是检测黄芪质量的重要参考指标，在抗氧化、促进细胞增殖、延缓衰老、抗炎、抗心肌肥厚等方面均有应用，本课题组前期利用PC12细胞，在细胞水平研究发现，毛蕊异黄酮具有抑制缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的作用[18]，但其在动物水平是否同样具有抑制神经细胞凋亡，减轻CIR损伤作用，亟需探索。

因此，本研究通过建立大脑中动脉闭塞模型，模拟CIR损伤环境，在动物水平，观察了不同剂量毛蕊异黄酮对CIR大鼠的神经保护作用，并初步探讨了毛蕊异黄酮拮抗CIR损伤的作用机制。实验结果发现， 模型组大鼠神经功能缺损症状明显，脑梗死体积明显增大，尼氏体明显减少，凋亡蛋白Caspase-3表达明显增多。当给予毛蕊异黄酮处理后，CIR大鼠神经功能障碍明显改善，脑梗死体积明显减少，尼氏体染色加深明显增多，凋亡关键蛋白Caspase-3表达明显降低。以上实验结果表明：毛蕊异黄酮可减轻CIR损伤，其分子机制与毛蕊异黄酮调控凋亡关键蛋白Caspase-3表达密切相关。