自体脂肪间充质干细胞对带状疱疹大鼠JNK、PI3K、NGF表达及后遗疼痛的影响

张书力 冯丹 (武汉市第一医院疼痛科，湖北 武汉 430022)

带状疱疹(HZ)是神经系统中水痘-带状疱疹病毒侵犯皮肤及神经所致，可引起受累神经根支配的皮肤区域疱疹，同时可伴有疼痛〔1〕。带状疱疹后神经痛(PHN)可引起患者视觉、听觉等其他神经系统并发症，并导致患者失明、耳聋、面瘫、脏器功能异常，甚至死亡〔2,3〕。PHN属于神经病理性疼痛(NP)，而背根神经节已成为NP的发病机制及其治疗重点〔4〕。PHN好发于老年人，但目前临床上的药物治疗、神经介入治疗及神经调控治疗等方法，治愈率效果不好，且患者疼痛长期难以控制〔5〕。近年，干细胞移植被用于多种NP的治疗〔6〕，取自骨髓、脂肪等组织的脂肪间充质干细胞(ASCs)，具有高度增殖和自我更新能力〔7,8〕，能分泌生物活性因子，刺激患者体内残留的特异性干细胞再生，进而发挥治疗作用〔9〕。ASCs可为许多疾病提供新的治疗方案，已成为临床研究的热点，但其对PHN的治疗作用却鲜见报道。神经生长因子(NGF)广泛分布于神经系统和非神经系统中，能介导c-Jun氨基末端激酶(JNK)及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途径调控神经和轴突生长、凋亡和再生，并能调节免疫系统功能，促进皮肤成纤维细胞修复〔10〕。目前研究发现NGF注射可用于治疗PHN〔11〕，但具体分子生物学机制不甚明确。本研究结果探究ASCs对PHN大鼠疼痛及NGF、JNK、PI3K蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1动物 清洁级同遗传背景SD雌性大鼠50 只，体重 200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为SYXK(京)2012-0001。分笼饲养于南京中医药大学实验动物中心，饲养条件：光照和黑暗各12 h交替进行，自由饮食、饮水，温度22～25℃，相对湿度40%～70%，噪音低于80 dB，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。

1.1.2主要试剂及仪器 CV-1非洲绿猴肾母纤维细胞(货号：XB-1192，购自上海奥陆生物科技有限公司)、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：HT019，购自上海歌凡生物科技有限公司)、白细胞介素(IL)-1β ELISA试剂盒〔货号：JK-(a)-4956，购自上海晶抗生物工程有限公司〕、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号E677218-0200，购自上海生物公司)、mNGF抗体(货号：ab32888)、PI3K抗体(货号：ab139307)、蛋白激酶B(Akt)抗体(货号：ab/18785)、磷酸化(p)-Akt抗体(货号：ab38449)、T酪氨酸激酶受体(TrkA)抗体(货号：ab216626)、TNF受体p75(p75NTR)抗体(货号：ab25958)、JNK抗体(货号：ab4821)、p-JNK抗体(货号：ab47337)、蛋白提取试剂盒(批号：NXTRACT-1KT，购自西格玛Sigma-Aldrich公司)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(货号：P0027，购自上海碧云天公司)。触觉测痛仪(型号：Von Frey Filament，购自Stoeling公司)、手动轮转式切片机(型号RM2125RTS，购自德国Leica公司)、光学显微镜(型号SMZ745，购自日本尼康公司)、蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号1659001、Trans-Blot SD，购自美国Bio-Rad公司)、凝胶成像仪(型号：GIS-500，购自Miulab公司)等。

1.2方法

1.2.1大鼠自体ASCs的分离、培养、鉴定、诱导 参照文献〔12〕在无菌条件下，取SD大鼠腹股沟皮下脂肪组织少许，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗净残留血液并去除血管|后，用0.1% Ⅰ型胶原酶在37℃条件下消化1 h，再加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液终止消化后，将消化液经孔径为100 μm和25 μm的尼龙膜过滤2次除去未消化的组织，离心收集细胞后。加入含10%FBS的DMEM培养液重悬细胞，置于37℃，5%CO2孵箱中培养24 h。72 h后移除悬浮细胞，待贴壁细胞生长融合至80%～90%时进行传代和纯化。取第3代ASCs加入异硫氰酸荧光素(FITC)-CD34抗体、FITC-CD45抗体、PE-CD29 抗体、FITC-CD90抗体和同型阴性对照鼠单克隆抗体振荡混匀，4℃避光孵育30 min。PBS洗涤后离心弃上清，加入200 μl含0.1%多聚甲醛的PBS溶液混匀固定，经流式细胞仪检测表型抗原。参照文献〔13〕取第3代ASCs分别加入成骨细胞和成脂细胞诱导培养基进行培养，待细胞分化稳定后经油红O染色观察脂质空泡，经茜素红染色鉴定钙结节。细胞传代培养14 d，每只大鼠可获得约4×106个ASCs，用生理盐水配制成1×106个/500 μl、2×106个/500 μl、4×106个/500 μl ASCs溶液。大鼠腹股沟缝合后1 w，伤口愈合，可用作后期试验。

1.2.2大鼠PHN模型建立及分组给药 参照文献〔12〕复制水痘带状疱疹病毒(VZV)和构建大鼠PHN模型，具体操作如下：DMEM/F12完全培养基培养非洲绿猴肾母纤维细胞(CV-1)，并将悬浮细胞按照5×104个/cm2的细胞数接种于培养瓶，加入VZV感染CV-1细胞2 d(约有80%细胞发生感染)，收集上述细胞，加入生理盐水重悬，即是病毒接种液。取1.2.1中50只SD大鼠，于左趾蹼注射50 μl病毒溶液，感染3 d后，大鼠出现机械痛敏阈值异常可判定制模成功。将造模成功的40只大鼠随机分为模型(PHN)组、ASCs〔13〕低(1×106个)、中(2×106个)、高(4×106个)剂量组；另取10只1.2.1中大鼠，于左趾蹼注射生理盐水作为空白对照(Control)组。造模成功后，参照文献〔14〕进行鞘内插管给药，插入管末端位于椎管L2节段，即脊髓L4～6节段，ASCs各组给予相应浓度的ASCs溶液500 μl，Control组和PHN组给予等剂量生理盐水500 μl，给药完成后轻轻取出插管，缝合肌肉和皮肤，苏醒后回笼正常饲养。

1.2.3各组大鼠机械缩足痛敏阈值(PWT)检测 各组大鼠行插管给药2 w后，参照文献〔15〕采用触觉测痛仪测定各组大鼠PWT。大鼠单次刺激时间≤1 s，每次刺激间隔10 s，当大鼠出现抬足或舔足行为或躲避时记录刺激强度，去掉最大及最小值，测定5次取平均值即为PWT。

1.2.4大鼠标本采集 测定完PWT后，3%戊巴比妥钠麻醉处死各组大鼠，立即切开背部皮肤组织及腰背筋膜，沿棘突两侧剥离骸棘肌并向两侧推开，放入自动牵开器撑开两侧肌肉组织，露双侧L4、L5、L6椎板,咬除L4、L5、L6棘突、椎板,关节突和部分椎弓根，小心显露双侧L4、L5、L6神经根及神经节，剪取0.5 g，匀浆后离心，取上清液于-20℃冰箱保存备用。迅速将剩余神经置于4%多聚甲醛中固定24 h。在鼠尾近段纵行切开皮肤、皮下组织至尾椎骨面，向两侧分离显露2个椎间盘，横向切开纤维环取出髓核组织，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.5各组大鼠背根神经节HE染色病理检查 取1.2.4中4%多聚甲醛中固定24 h后的L4、L5、L6神经根及神经节，进行常规透明、浸蜡、包埋后、切成厚度为5 μm的切片。按HE试剂盒说明书进行染色，置于显微镜下观察神经节神经细胞形态变化。

1.2.6各组大鼠髓核组织炎症因子TNF-α、IL-1β含量测定 取1.2.4中-80℃冰箱中冻存的髓核组织，制备匀浆，离心分离后，取匀浆上清液，按ELISA试剂盒说明书方法，分别检测组织TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7Western印迹检测神经节组织mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3蛋白表达 取1.2.4中-20℃保存的组织匀浆液，于4℃冰箱中解冻后，取上清液，用轴蛋白试剂盒提取蛋白，BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度后，取50 μg蛋白上样，进行电泳和转膜反应，TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗〔mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3、β-actin(内参)抗体，稀释倍数分别为1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶2 000〕，4℃摇床室温孵育过夜，TBST振洗后加入辣根过氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(稀释倍数1∶2 000)，37℃摇床室温孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以ImageJ软件分析各组蛋白相对表达。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析，进一步两组间比较行SNK-q检验。

2 结 果

2.1大鼠自体ASCs体外培养、鉴定结果 体外培养的第3代大鼠ASCs形态均一、贴壁、呈成长梭行。经流式细胞仪检测，CD90和CD29表达均>95%,CD34和CD45表达呈阴性。体外成脂诱导液培养后，细胞能分化为成脂肪细胞，且红油O染色显示成脂质空泡阳性。体外成骨诱导液培养后，细胞能分化为成骨细胞，且茜素红染色显示有钙结节。见图1。

图1 大鼠ASCs体外培养、鉴定结果

2.2大鼠背根神经节HE染色结果 Control组大鼠背根神经节内神经元细胞形态完整，核仁清晰，分布均匀。与Control组相比，PHN组大鼠背根神经节内神经元细胞形态和大小不一、边界不清，可见细胞变形、溶解、坏死等病理损伤。与PHN组相比，ASCs低、中、高剂量组大鼠背根神经节病理损伤逐渐减轻，见图2。

2.3各组大鼠PWT检测结果 与Control组〔(42.56±4.25)s〕相比，PHN组PWT降低〔(16.86±2.93)s，P<0.05〕；与PHN组相比，ASCs低、中、高剂量组PWT依次明显增高〔(22.35±2.76)s、(29.26±2.82)s、(35.22±2.65)s，均P<0.05〕。

图2 各组背根神经节HE染色结果(×200)

2.4各组髓核组织炎症因子TNF-α、IL-1β含量检测结果 与Control组相比，PHN组、ASCs低、中、高剂量组髓核组织TNF-α、IL-1β含量升高(均P<0.05)；与PHN组相比，ASCs低、中、高剂量组大鼠髓核组织炎症因子TNF-α、IL-1β含量依次明显降低(均P<0.05)，见表1。

表1 各组髓核组织TNF-α、 IL-1β含量比较

2.5各组背根神经节组织mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3蛋白表达 与Control组，PHN组、ASCs低、中、高剂量组背根神经节组织mNGF、PI3K、p-Akt、TrkA p75NTR、p-JNK蛋白表达显著降低，Caspase-3蛋白表达明显升高(均P<0.05)；与PHN组相比，ASCs低、中、高剂量组mNGF、PI3K、p-Akt、TrkA p75NTR、p-JNK蛋白表达依次明显升高，Caspase蛋白表达依次明显降低(均P<0.05)。见图3，表2。

1～5：Control组，PHN组，ASCs低剂量组，ASCs中剂量组，ASCs高剂量组图3 Western印迹检测各组mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、 TrkA、p75NTR、JNK、p-JNK、Caspase-3蛋白表达

表2 大鼠背根神经节组织mNGF、PI3K、Akt、p-Akt、TrkA蛋白表达比较

3 讨 论

PHN可持续数周、数月甚至数年，导致患者出现情感障碍、焦虑、抑郁等，严重影响患者的生活质量〔4〕。皮损区的异常疼痛及痛觉过敏为PHN的主要表现，接种疱疹病毒，可造成外周神经纤维坏死，神经支配区皮肤出现疱疹和炎症反应，感觉神经节出现炎症、出血性坏死及神经元坏死或缺失〔16〕。钱黎等〔17〕用疱疹病毒复制大鼠PHN模型，发现大鼠存在严重的痛觉过敏，PWT减少；马洪涛等〔15〕通过接种VZV复制PHN模型，发现大鼠在接种后7 d痛觉达到高峰，并能持续14 d，脊髓炎症因子TNF-α、IL-1β等释放增加。本研究提示PHN模型大鼠出现痛觉过敏、炎症反应和背根神经节神经细胞坏死，表明造模成功。

PHN属于NP一种，当人体免疫力下降时，病毒在背根神经节内繁殖，引起感觉神经元受损，导致炎症介质释放，伤害感受器敏化，自发性疼痛增加，而随着病情增加，神经纤维持续性异常放电，最终形成PHN。干细胞移植可被用于多种NP的治疗，且自体ASCs移植具有安全性及有效性〔18〕。Elchim等〔19〕采用鞘内注射异体脐带干细胞方法治疗，可显著降低脊髓外伤诱发NP男性患者疼痛程度，改善运动功能及自主神经功能；Vickers等〔20〕将ASCs注入10位难治性三叉神经痛女性患者病变的三叉神经周围，发现半年内患者疼痛程度均显著降低，镇痛药物需求量显著减少；Franchi等〔21〕发现注射神经干细胞，可明显减轻神经损伤模型大鼠诱发痛及热痛觉过敏，且大鼠疼痛缓解程度与单次移植的干细胞数目呈正相关。本研究结果推测自体ASCs移植可能通过修复背根神经节神经元细胞损伤和坏死，降低髓核组织炎症损伤，缓解PHN大鼠疼痛，但其修复机制不清楚。

NGF可由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生，具有促进中枢和外周神经分化、再生、调控神经系统发育和维持神经系统正常等功能〔10〕。近年研究发现，体外注射NGF可改善PHN症状，蓝丽康等〔22〕发现肌内注射NGF可治疗老年PHN，且疼痛缓解有效率和安全性较高。但NGF缓解PHN症状的分子机制，还不甚明确。研究发现NGF可与TrkA受体结合，通过PI3K/Akt途径调控神经和轴突生长、凋亡和再生，且可与p75NTR受体结合，通过JNK途径促进细胞凋亡〔11〕。Sang等〔23〕发现姜黄素对坐骨神经损伤患者神经元的保护作用，可能与上调NGF表达和激活PI3K/Akt通路有关；Blom等〔24〕发现JNK通路参与神经细胞增殖；郑培兵等〔25〕发现NGF能通过上调JNK表达，促进神经元轴索的生长。本研究结果表明PHN模型大鼠中NGF表达减少，其介导的PI3K/Akt和JNK通路处于抑制状态，可能与PHN大鼠神经元变性、损伤、凋亡有关。本研究结果推测自体ASCs移植修复PHN大鼠背根神经节神经元细胞损伤及缓解疼痛的作用，可能通过激活NGF介导的PI3K/Akt和JNK通路实现。

综上，自体ASCs移植可能通过激活NGF介导的PI3K/Akt和JNK通路，修复背根神经节神经元细胞损伤和坏死，缓解PHN大鼠疼痛，初步为自体ASCs移植应用于临床治疗PHN提供了理论参考。但本研究还存在一定不足，自体ASCs移植改善PHN大鼠疼痛的机制和途径相当复杂，本研究未设置通路抑制剂进行验证，有待后续继续研究。