NapsinA、CGA及CK7在肺癌患者中的表达及与临床病理的关系分析

黄玉惠，余婧，李景

(成都市双流区第一人民医院病理科，四川 成都 610200)

肺癌是起源于肺支气管上皮黏膜组织或腺体组织的原发性癌，依据病理组织学不同分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85%～90%[1]。肺癌的发病呈家族聚集性，遗传、职业暴露、环境、不良饮食、吸烟、基因突变等因素均是肺癌发病的高危因素[2]。早期肺癌的检出率约为15%，局部晚期或转移期肺癌的诊断率可达75%[3]。早期肺癌多通过手术切除、化学治疗、靶向分子治疗等方式进行，晚期肺癌伴转移患者则多采用免疫疗法进行治疗。尽管靶向分子技术和精准医疗在肺癌的临床诊断和治疗中应用日渐广泛，一定程度可提高肺癌患者的生存率，但晚期肺癌生存率仍不足15%[4]。天门冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、嗜铬粒蛋白A(chromograninA，CGA)和细胞角蛋白7(Cytokeratin 7，CK7)作为肿瘤特异性标志物，被证实可辅助鉴别肺癌组织学类型，帮助明确病情，制定合适的治疗方案及预测预后[5]。本研究旨在探讨天门冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、嗜铬粒蛋白A(CGA)及细胞角蛋白7(CK7)在肺癌患者中的表达及与临床病理的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月至2019年11月成都市双流区第一人民医院收治的109例肺癌患者的肺癌组织及癌旁组织为研究对象。109例患者中，男性64例，女性45例；年龄为29～74岁，平均(50.34±6.87)岁；有吸烟史77例，无吸烟史32例；病理类型：肺腺癌31例，肺鳞癌24例，大细胞癌8例，小细胞癌46例；低分化癌23例，中分化癌55例，高分化癌31例；TNM分期：I～II期42例，III～IV期67例；出现淋巴结转移38例，未出现淋巴结转移71例；手术治疗15例，放疗41例，化疗53例。纳入标准：(1)符合《中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)》[6]中指出的肺癌相关诊断标准，术中取病理标本，均经病理证实为肺癌者；(2)入院前未接受过放、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗者；(3)年龄≥18周岁。排除标准：(1)合并糖尿病、冠心病等基础疾病者；(2)重要器官功能不全者；(3)合并其他慢性肺功能疾病者；(4)合并其他恶性肿瘤疾病者。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集所有患者性别、年龄、吸烟史等一般资料，同时收集其病理类型、肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况等临床资料。对所有患者进行为期两年的随访，随访方式包括定期入院复查随访及电话随访。

1.2.2 NapsinA、CGA、CK7在肺癌组织及癌旁正常组织表达情况 取肺癌患者癌组织及临近癌旁组织标本(距肿瘤边缘5 cm处)[7]，以10%中性甲醛固定后脱水制成石蜡切片，采用免疫组织化学技术S-P法[8]检测癌组织及癌旁正常组织中NapsinA、CGA、CK7的阳性表达。将癌组织和癌旁组织标本石蜡切片贴附于预涂有多聚赖氨酸的载玻片上，加热至60 ℃烘烤2 h，梯度二甲苯脱蜡至水后浸泡，取出切片置于pH值为6.0的枸橼酸盐缓冲液中，加热至100 ℃维持10 min后冷却，pH值为7.4的枸橼酸盐缓冲液冲洗3次，滴加兔抗NapsinA(货号：ab129189，abcam公司)、CGA(货号：ab92738，abcam公司)、CK7单克隆抗体(货号：ab68459，abcam公司)，37 ℃条件下孵育1 h，pH值为7.4的枸橼酸盐缓冲液再次冲洗3次后滴加生物素标记的相应山羊抗兔二抗，37 ℃条件下孵育40 min，pH值为7.4的枸橼酸盐缓冲液再次冲洗3次后滴加DAB显色液，水洗后苏木素复染30 s，蒸馏水冲洗5 min后梯度乙醇脱水后透明封片。

1.2.3 免疫组化结果进行判定 以枸橼酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知肺癌阳性切片作为阳性对照对结果进行判定。NapsinA、CGA和CK7均定位于细胞质中，当细胞质被染色成黄色或棕黄色，且呈明显颗粒状视为阳性[9]。随机选择阳性细胞区域的10个高倍视野，结合阳性细胞占比和染色强度对染色结果进行评分，阳性细胞占比为0%记0分，1～10%记1分，11～50%记2分，50%以上记3分；染色强度无上色记0分，上色较弱记1分，上色程度中等记2分，上色程度较强记3分。总分=阳性细胞占比得分×染色强度得分，将总分为0分判定为阴性(-)，总分为1～2分判定为弱阳性(+)，总分为3～4分判定为阳性(++)，总分在4分以上判定位强阳性(+++)。

1.3 观察指标

(1)肺癌组织及癌旁组织中NapsinA、CGA、CK7的表达；(2)NapsinA、CGA、CK7表达与临床病理的关系；(3)NapsinA、CGA、CK7表达与预后的关系。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肺癌组织及癌旁组织中NapsinA、CGA、CK7的表达比较

NapsinA在肺癌组织中阳性率为62.39%，高于癌旁组织的21.10%(P<0.05)；CGA在肺癌组织中的阳性率为57.80%，高于癌旁组织中的27.52%(P<0.05)；CK7在肺癌组织中的阳性率为64.22%，高于癌旁组织的58.72%(P<0.05)。见表1及图1。

表1 肺癌组织及癌旁正常组织中NapsinA、CGA、CK7的表达[n(%)]

2.2 NapsinA表达与临床病理的关系

NapsinA表达与患者性别、年龄、有无吸烟史、治疗方式和肺癌分化程度无关(P>0.05)；与病理类型、TNM分期和有无淋巴结转移有关(P<0.05)；病理类型为肺腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴结转移的患者肺组织内NapsinA阳性表达率越高。见表2。

表2 NapsinA表达与临床病理的关系[n(%)]

2.3 CGA表达与临床病理的关系

CGA表达与患者性别、年龄、有无吸烟史、治疗方式、肺癌分化程度和淋巴结转移无关(P>0.05)；与病理类型和TNM分期有关(P<0.05)；病理类型为大细胞癌、小细胞癌、TNM分期越晚的患者肺组织内CGA阳性表达率越高。见表3。

表3 CGA表达与临床病理的关系[n(%)]

2.4 CK7表达与临床病理的关系

CK7表达与患者性别、年龄、有无吸烟史、治疗方式和肺癌分化程度无关(P>0.05)；与病理类型、TNM分期和有无淋巴结转移有关(P<0.05)；病理类型为腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴结转移的患者肺组织内CK7阳性表达率越高。见表4。

表4 CK7表达与临床病理的关系[n(%)]

2.5 NapsinA、CGA、CK7表达与预后的关系

NapsinA阳性患者中位生存期为18个月，CGA阳性患者中位生存期为19个月，CK7阳性患者中位生存期为18个月，均低于NapsinA、CGA和CK7阴性的患者(P=0.001、0.001、0.003)。见图2。

3 讨论

NapsinA属于天门冬氨酸水解蛋白酶家族中的一员，广泛表达于II型肺泡表面上皮细胞和肺泡巨噬细胞表面[10]，通过其蛋白水解活性诱导肺表面活性蛋白的合成分泌，进而发挥维持肺形态和肺功能的作用[11]，已证实是肺腺癌诊断的特异性标志物[12]。CGA是酸性可溶蛋白的一种，由439个氨基酸分子组成，普遍存在于神经内分泌细胞致密核心颗粒中[13]，被广泛用作神经内分泌的标志物[14]。CK7是碱性细胞角蛋白的一种，相对分子量约为54 kDa，广泛存在于正常组织移行上皮及腺山沟细胞内，而在非上皮来源的细胞和组织中少量表达或不表达[15]，CK7既往常用于实体瘤转移部位细胞来源的判断和鉴别[16]。本研究中，肺癌组织NapsinA、CGA、CK7阳性表达高于癌旁组织(P<0.05)，原因可能在于随着肿瘤进展的加剧，癌细胞不断增殖、分化、发育，定位于细胞质中的NapsinA、CGA和CK7等肿瘤标记物的表达也随之发生变化，NapsinA、CGA和CK7在肺癌细胞质中表达水平均随着癌细胞的快速扩增而显著增加，电镜下表现出典型的棕黄色及深褐色颗粒状染色，阳性细胞占比逐渐大，着色程度逐渐加深，表明NapsinA、CGA、CK7具有作为肺癌早期诊断肿瘤标志物的潜力，可将肿瘤组织和癌旁正常组织进行有效区分。本研究结果显示，病理类型为肺腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴结转移的患者肺组织内NapsinA阳性表达率越高；病理类型为大细胞癌、小细胞癌、TNM分期越晚的患者肺组织内CGA阳性表达率越高；病理类型为腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴结转移的患者肺组织内CK7阳性表达率越高。推测原因可能与NapsinA、CK7和CGA自身特性有关，NapsinA和CK7普遍表达于肺腺癌细胞中，而在鳞癌、小细胞癌等其他类型的肺癌细胞中很少表达或几乎不表达。CGA主要与神经内分泌肿瘤如大细胞癌、小细胞癌有关，在腺癌和鳞癌中几乎不表达[17]，造成不同病理类型的肺癌患者NapsinA、CK7和CGA阳性率不同，表明NapsinA、CK7和CGA对肺癌病理类型的鉴别作用较好。而肿瘤分期越晚、存在淋巴结转移的患者肺癌进展越快，肿瘤细胞增殖加快，定位于肺癌细胞质中的NapsinA、CK7和CGA阳性率随之增加，最终导致NapsinA、CK7和CGA阳性率与病理类型、TNM分期和淋巴转移均高度相关。此外，本研究结果还发现，NapsinA、CGA和CK7阳性患者中位生存期均低于NapsinA、CGA和CK7阴性的患者(P<0.05)。TNM分期越晚，肿瘤浸润越严重，出现淋巴结转移和远处转移的可能性更高，肺癌恶性程度也随之增加[18]，导致NapsinA、CGA和CK7阳性患者生存期更短，预后明显低于阴性患者[19]。提示NapsinA、CGA和CK7阳性率不仅与患者的病理类型、TNM分期和淋巴结转移有关，还可以作为预测患者预后的有效分子，对于早期筛查以及预后评估均具有较好的价值，可能与NapsinA、CGA和CK7分子影响癌细胞增殖、凋亡等细胞周期的调控机制有关。NapsinA、CGA和CK7阳性表达增加不仅可影响肺癌细胞的适应能力，导致癌细胞增殖加快，增加其粘附能力，还通过刺激细胞内相关转录因子的表达诱导局部氧化应激损伤，介导癌细胞凋亡抑制，最终加速肺癌进展[20]，影响患者预后。

综上所述，与癌旁正常组织相比，肺癌组织中NapsinA、CGA、CK7阳性率更高，且阳性患者预后较阴性患者更差，与患者病理类型、TNM分期及淋巴结转移与否有关，临床可加强对肺癌患者组织中NapsinA、CGA和CK7表达的监测，以提高肺癌的检出率，评估预后。