汉麻籽粕酶解物中抗肝癌Hep3B细胞活性肽的分离与鉴定

魏连会， 董 艳， 石 杰， 宋淑敏， 李国巍， 孙兴荣

(黑龙江省科学院大庆分院1，大庆 163319)(黑龙江省农业科学院大庆分院2，大庆 163316)

汉麻(CannabissativaL)也称为火麻、汉麻、线麻、黄麻等，是一种一年生草本植物，广泛种植在中国和加拿大等地区[1]，是工业用途汉麻纤维、种子、油和粕的重要原料来源[2,3]。其中四氢大麻酚(Δ-9-tetrahydrocannabinol, THC)质量分数低于0.3%，为无毒品种。目前在世界各地几十个国家已被批准种植和加工[4]，并已被用于开发系列汉麻产品，广泛应用于化妆品、功能性食品和营养保健品行业[5]。汉麻籽的药用功效在2000年版《药典》和2001年“药食同源”名单中均有记载[6]。汉麻籽中含有不饱和脂肪酸、蛋白质，以及所有人体必需氨基酸[7]。

汉麻籽蛋白经水解后产生的汉麻籽多肽具有多种健康功效和药用价值。其生物活性已经被证实，如抑制血管紧张素转换酶(ACE)[8]、抑制肾素[9]、抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)[10]、金属结合能力[11]、抗氧化活性[12]、降胆固醇作用[13]和血糖调节作用[14]。

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，是世界范围内发病和死亡的主要疾病之一[15，16]。目前，主要的肝癌化疗药物有5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、紫草素等，这些药物有严重的副作用且价格昂贵[17]。因此，寻找一个既便宜又高效且副作用小的化疗药物迫在眉睫。多肽，除了具有营养价值外，还有其他的生物活性，其中包括抗癌作用。相比传统药物、多肽具有高亲和力、强特异性、低毒性和充足的组织渗透[18]。一些研究已经证明食源性蛋白质、多肽和氨基酸对癌细胞凋亡、血管生成具有调节作用，显示出抗肿瘤的潜力，这些肽具有抗肿瘤、抗增殖、抗炎等作用[19]，这些肽的抗癌活性主要通过诱导肿瘤细胞自噬或凋亡，如玉米肽、绿豆肽和大豆肽等[20-24]。然而，汉麻籽多肽的抗癌作用及具有抗癌活性的多肽的结构鉴定鲜见报道。

多肽的结构决定着生物活性肽的生理功能，明确氨基酸的组成对揭示构效关系具有重要的意义[25，26]。因此，在本研究中，利用复合蛋白酶酶解汉麻籽粕，制备了汉麻籽蛋白水解物，通过超滤分离对汉麻籽多肽进行初步纯化，测定汉麻籽多肽的抗肝癌Hep3B细胞作用，采用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定多肽结构，最后通过合成汉麻籽多肽进一步验证其抗肝癌活性，旨在为汉麻籽抗肝癌活性肽的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

汉麻籽粕水解物；木瓜蛋白酶(酶活力为 8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力为 1.3×105U/g)； Hep3B 细胞；人正常肝细胞L02。

1.2 仪器与设备

4800 Plus MALDI TOF/TOFTM分析仪，AB SCIEX质谱仪，pellicon 切向流过滤系统，FD-2A-80型真空冷冻干燥机，800TS酶标仪。

1.3 实验方法

1.3.1 汉麻籽粕酶解物制备与多肽的分离纯化

称取一定质量汉麻籽粕，按照1∶5的比例加入蒸馏水溶解，加入5.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH为5.5，酶解温度为75 ℃，酶解时间为3 h，95 ℃水浴灭酶15 min，10 000 r/min离心15 min，分离取汉麻籽粕上清液。将酶解得到的汉麻籽粕酶解液，通过切向流膜过滤系统，进行分离纯化，采用的过滤膜截留分子质量为3 ku，收集分子质量小于3 ku汉麻籽多肽肽段，用真空冷冻干燥机冻干备用。

1.3.2 汉麻籽多肽抗肝癌Hep3B 细胞活性研究

1.3.2.1 细胞培养

将肝癌Hep3B肝癌细胞系和LO2正常肝细胞在含质量分数10%牛血清(FBS)和质量分数1%双抗的DMEM培养液中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3.2.2 细胞活力研究

采用MTT比色法检测细胞活力。将肝癌Hep3B细胞和正常LO2细胞接种于96孔板中，每孔体积为200 μL(细胞数约为每孔 4×104个/mL)，向每孔中加入不同质量浓度的汉麻籽多肽(0、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL)孵育24 h，向每孔滴加噻唑蓝溶液(终质量浓度为 5 mg/mL)，放回培养箱内37 ℃、5% CO2继续培养2 h， 然后取出上清液将孔内的培养液小心吸出，使用 PBS 轻轻的冲洗 1～3次。吸走 PBS后，每孔加入100 μL的 DMSO 溶剂，并放在摇床上慢速混匀 15 min。用酶标仪测量吸光度(A490)值，计算细胞存活率。

1.3.3 汉麻籽多肽组分的分子质量分布范围测定

采用MALDI-TOF 基质辅助激光解析飞行时间质谱对汉麻籽粕酶解物的分子质量范围进行测定[27]。

1.3.4 汉麻籽抗肝癌活性肽组分的氨基酸序列分析

采用 MALDI-TOF-TOF质谱重新进行肽段测序，具体操作如下：取1 μL汉麻籽多肽样品点至样品靶上，自然干燥后，再取1 μL CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻靶位上点校准标准品干燥，用相同方法在样品靶位相邻靶位上点校准标准品(4 700蛋白质组学分析交叉校准混合物1)。

校准混合物1进行外标一级校准，分子质量误差小于0.5 u；采集图谱条件：一级质谱(MS)范围：800～4 000m/z，每张谱图累加500个激光光束；选择供试品目标多肽对应母离子进行二级质谱测试(MS/MS)，每张谱图累加2 500个激光光束，在主要参数固定的前提下，分别调整激光强度和碰撞室(CID)气体气压来获取最佳谱图。

1.3.5 抗肝癌活性多肽的合成及功能验证

以获得的抗肝癌活性多肽为目标，委托上海某公司进行合成，共合成YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH 4种多肽，并对合成多肽的纯度与一级结构进行分析。同时，测定不同浓度合成多肽对肝癌Hep3B细胞的抑制活性。

2 结果与分析

2.1 汉麻籽多肽抗肝癌活性的研究

如图1所示，以不同质量浓度(0、0.5、1、2、5、10、20 mg/mL) 汉麻籽多肽处理细胞24 h后，采用MTT法测定细胞活力。结果表明，在一定的浓度范围内，汉麻籽多肽可有效抑制Hep3B肝癌细胞的增殖，降低细胞存活率，但不影响LO2正常肝细胞的生长，随着汉麻籽多肽浓度的增加，汉麻籽多肽对肝癌Hep3B细胞的抑制作用逐渐增强，呈现出一定的量效关系。

图1 汉麻籽多肽对Hep3B细胞存活率的影响

2.2 汉麻籽多肽的分子质量分布测定

为获得汉麻籽生物功能肽，利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解汉麻籽粕。采用MALDI-TOF/TOF质谱分析汉麻籽多肽超滤分离组分的分子质量，分布范围如图2所示。生物活性肽通常含有2～20个氨基酸并具有多种生物活性。由图2可知，汉麻籽多肽的分子质量检测结果表明，多肽的分子质量主要在200～1 500 ku范围内，说明得到的汉麻籽多肽主要是由2～10个氨基酸残基组成的小肽段。宋淑敏等[27]研究表明，寡肽尤其是二肽或三肽，较容易被人体有效吸收并经人体小肠黏膜利用。因此，汉麻籽多肽也可能被人体有效吸收，从而发挥其生物学作用。

图2 汉麻籽多肽的分子质量分布

2.3 汉麻籽多肽的质谱鉴定结果

根据多肽组分的分子质量分布，采用MALDI-TOF-TOF质谱重新进行肽段的测序，对4个峰值较高的肽段进行序列分析，多肽序列分析结果及质谱如表1，共鉴定出4种多肽序列，分别是YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。

表1 汉麻籽多肽的氨基酸序列分析

2.4 多肽合成及活性测定

合成多肽YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH的纯度分别为98.90%、98.03%、99.90%、98.63%同时对合成多肽的抗肝癌Hep3B细胞活性进行测定，如图3所示。结果表明，汉麻籽多肽YGRDEISVF和NKSGTYSNDDLSH具有很强的抗肝癌细胞增殖作用。

注：LO2-正常肝脏细胞；Hep3B为人肝癌细胞。a～d分别为合成多肽YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。图3 合成多肽对肝癌Hep3B 细胞的存活率的影响

3 结论

本实验采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对汉麻籽粕进行酶解，利用超滤系统分离纯化，得到分子质量小于3 ku 的小分子多肽。探究汉麻籽多肽的抗肝癌作用，实验证明了汉麻籽多肽能够抑制肝癌Hep3B 细胞的增殖，同时对正常的肝细胞无毒副作用。采用质谱分析汉麻籽多肽的分子质量分布范围及其高峰值的序列特征，鉴定了4种小肽的氨基酸序列为YGRDEISVF、NPEDEFEKIR、RSSPGALDKFVSG、NKSGTYSNDDLSH。经固相合成，合成肽的分子质量分别为1 085.20、1 276.35、1 320.30、1 437.20 u，其纯度分别为98.90%、98.03%、99.90%、98.63%。同时，合成多肽YGRDEISVF、NKSGTYSNDDLSH具有很强的抗肝癌细胞增殖作用。