氯化钙破乳辅助水酶法提取江永香柚籽油工艺的研究

张佳蒙， 刘千千， 王东梅， 肖新生， 蒋黎艳

(湖南科技学院化学与生物工程学院，永州 425199)

柚(Citrusgrandis)属芸香科常绿乔木，原产东南亚，在中国种植广泛。湖南省江永县为柚子重要产区，所产“江永香柚”与香芋、香菇、香姜和香米并列“江永五香”[1]。香柚具有清肺、消食、降血压、通便、顺气等药用价值，能促进人体的新陈代谢，维持正常的生理活动，对治疗败血症和解酒轻身也有一定的效果[2，3]。香柚柚果经鲜食或加工后，产生约35%～55%皮渣和果核，多被废弃处理，既污染环境又浪费资源[4]。目前，香柚柚皮和果实的开发已被广泛研究，然而香柚加工的副产品柚子籽却未得到综合利用。据测定柚子籽的油脂质量分数丰富[5，6]，一般在40%以上；此外，柚子籽较其他柑橘类籽大，质量为柚子整果肉质量的0.1%～4.0%，有较高的实用价值，可以作为新的油脂资源。

水酶法是一种在酶法基础上发展形成的脂类提取方法，利用非油成分对油和水的亲和力差异及油水比重不同将非油成分和油分离[7]。相对于传统的油脂提取方法，水酶法反应条件温和，油脂精炼工艺流程少，所使用的酶安全无毒、易降解，且绿色、经济环保等[8，9]。Hu 等[10]发现水酶法提取得到的油的生育酚、酚类物质含量比己醇提取的油更高，此外，氧化稳定性也更好。然而，水酶法在提油过程中会产生一种水中含油(O/W)的乳状液，稳定乳状液的形成会降低水酶法的提油率。为了减少乳状液的形成，可采用加热、冻融、酶法、溶剂等多种方法对乳状液进行破乳，其中添加乙醇、CaCl2和调节pH等破乳方法具有成本低、操作简单等优点。Fang等[11]采用添加乙醇水溶液对水酶法提取的油茶籽油进行破乳研究，结果发现水酶法提取与破乳相结合，可提高8.83%提取率。Liu等[12]研究添加不同无机盐对水酶法提取花生油形成乳状液的破乳效果，结果发现不同无机盐的加入均可降低乳状液的稳定性，其中CaCl2破乳率最高。郝佳等[13]采用调节pH法对水酶法提取的稻米油进行破乳研究，结果发现在pH为7时，破乳率可达到93.15%。

目前水酶法已被广泛应用于山苍子核仁油[14]、椰子油[15]、野杏仁油[16]、芝麻油[17]等多种油料种子中油脂的提取，然而运用氯化钙破乳辅助水酶法提取江永香柚籽油工艺的研究还鲜见报道。因此，本实验以江永香柚籽为原材料，研究在水酶法提取过程中添加氯化钙来减少乳液形成和增加油脂提取率的方法，并对提取工艺的条件进行了优化，旨在为新资源油脂的开发利用和江永香柚加工副产物的综合利用现状提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

江永香柚；碱性蛋白酶(100 000 U/g)、纤维素酶(100 000 U/g)、CaCl2、NaOH、HCl、酚酞溶液、碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液、韦氏试剂、乙醇、百里酚酞、冰乙酸、三氯甲烷、石油醚、无水硫酸钠、重铬酸钾等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TDZ-WS低速离心机，FW-177摇摆式中药粉碎机，GC-2010Plus气相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 原料的制备

挑选大小均匀、无机械伤、无病虫害、无腐烂的江永香柚，沿十字方向纵切，去掉外皮、果肉，取其内核，在90 ℃烘箱中烘6 h，去除外壳取其种仁，粉碎机粉碎过40目筛，密封保存备用。

1.3.2 氯化钙破乳辅助水酶法的提取工艺

准确称取2.00 g粉碎过的样品与16 mL蒸馏水混合在100 mL锥形瓶中，质量比为1∶8。将混合物加热到90 ℃，保持10 min，冷却至酶解温度50 ℃。使用0.1 moL/L NaOH和HCl将料浆pH调整到6.0再添加一定量的纤维素酶，50 ℃培养1 h。再用2 moL/L NaOH调整悬浮液pH至适宜pH，然后加入一定量的碱性蛋白酶。将混合物在一定的温度下酶解一定的时间，同时按特定的加入方式加入一定比例的氯化钙，酶解结束后90 ℃灭酶10 min，冷却至室温。酶解液以3 000 r/min离心30 min，离心后，仔细收集油并称重，计算得率。

香柚籽油得率=

1.3.3 单因素实验

按照1.3.2节所述实验方法，设置单因素实验考察水酶法对香柚籽油得率的影响，双酶分步水解可提高提油效率[16，18]，且根据初步预实验发现碱性蛋白酶的酶解条件对香柚籽油得率的影响要高于纤维素酶。因此，在纤维素酶水解后，以纤维素酶与碱性蛋白酶质量比1∶1 的实验条件下，进行碱性蛋白酶的水解条件优化，单因素水平设置如下：pH为6、7、8、9、10，酶添加量为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%，酶解温度40、45、50、55、60 ℃，酶解时间3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5 h，破乳剂氯化钙加入方式为未加入、一次加入、分批加入、取乳液加入，氯化钙与原料比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，每个单因素实验重复3次，结果取平均值。

1.3.4 响应面分析

在单因素实验结果的基础上，采用响应面法对香柚籽油得率的工艺参数进行优化，利用响应面Box-Behnken设计，选取影响香柚籽油得率较大的四个因素：pH、酶解温度、酶解时间和氯化钙与原料比为提取变量，香柚籽油得率为响应值，设计响应面分析实验。

1.4 香柚籽油理化指标测定

香柚籽油过氧化值参照GB 5009.227—2016[19]测定；香柚籽油酸价参照GB 5009.229—2016[20]测定；香柚籽油碘价参照GB/T 5532—2008[21]测定；香柚籽油皂化值参照GB/T 5534—2008[22]测定。

1.5 香柚籽油脂肪的测定

参照GB 5009.168—2016[23]：0.1 g样品油与8 mL、2%NaOH-CH3OH溶液充分混匀，在(80±1) ℃水浴中回流，直至油滴消失。从回流冷凝器上端加入7 mL、15%BF3-CH3OH充分混匀，在(80±1) ℃水浴中继续回流2 min，用少量水冲洗回流冷凝器。停止加热，从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温。准确加入10～30 mL正己烷，振摇2 min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正己烷提取溶液大约5 mL，至25 mL试管中，加入大约3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，吸取上层溶液待测。

色谱参考条件：GC条件：色谱柱：Rtx-WAX (30 m×0.32 mm×0.25 μm)；温度程序：200 ℃恒温分析；载气(N2)，流速：1.0 mL/min，进样量：1 μL，分流比：20∶ 1。

1.6 数据分析与处理

运用Design Expert 12软件处理数据，使用Origin Pro 8.6、Excel软件画图，进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 不同pH对香柚籽油得率的影响

在先添加1.2%纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)培养1 h，再添加1.2%碱性蛋白酶(50 ℃)酶解4.5 h ，氯化钙与原料比为1∶4一次加入的条件下，考察碱性蛋白酶不同pH对香柚籽油得率的影响。由图1可知，在pH为6～8时，随着pH的增加，香柚籽油的得率也逐渐增大；在pH为8～10范围内，随着pH的增加，香柚籽油的得率逐渐降低，这可能是因为继续增大pH会对碱性蛋白酶的活性起到强烈抑制作用，降低了酶的活性，进而导致香柚籽油得率降低。因此，最终选择pH 8作为提取条件。

图1 各因素对香柚籽油得率的影响

2.2 不同酶添加量对香柚籽油得率的影响

在先添加纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)培养1 h，再添加碱性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)酶解4.5 h，氯化钙与原料比为1∶4一次加入的条件下，考察不同酶添加量对香柚籽油得率的影响。由图1可知，在酶添加量为0.6%～1.4%时，随着酶添加量的增加，香柚籽油的得率逐渐增大；在酶添加质量分数为1.4%～2.0%时，随着酶添加量的继续增加，香柚籽油的得率逐渐趋于稳定。分析原因可能是因为在酶解过程中，充分的底物与添加适量酶作用，从而使香柚籽油得率增大；继续增加酶添加量，底物量有限，过量酶会对油脂产生吸附作用，使酶在体系中香柚籽的表面附着，从而影响油脂的释放，得率趋于稳定。因此，最终选择酶添加量1.4%作为提取条件。

2.3 不同酶解温度对香柚籽油得率的影响

在先添加1.2%纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)培养1 h，再添加1.2%碱性蛋白酶(pH 8.0)酶解4.5 h， 氯化钙与原料比为1∶4一次加入的条件下，考察不同酶解温度对香柚籽油得率的影响。由图1可知，在酶解温度为40～50 ℃时，随着酶解温度的增加，香柚籽油的得率也逐渐增大；在酶解温度为50～60 ℃时，随着酶解温度的继续增加，香柚籽油的得率逐渐降低。分析原因可能是因为在一定的温度范围内，随着温度的升高可以增加分子的运动和扩散作用，反应速度增大，从而香柚籽油的得率逐渐增大；然而当温度超过酶的最适温度时，酶的中心结构受影响，酶的催化活性降低，从而得率降低。因此，最终选择酶解温度50 ℃作为提取条件。

2.4 不同酶解时间对香柚籽油得率的影响

在先添加1.2%纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)培养1 h，再添加1.2%碱性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)进行酶解， 氯化钙与原料比为1∶4一次加入的条件下，考察不同酶解时间对香柚籽油得率的影响。由图1可知，在酶解时间为3～5 h时，随着反应时间的增加，香柚籽油的得率也逐渐增大；在酶解时间为5～6.5 h范围内，随着酶解时间的继续增加，香柚籽油的得率先下降再逐渐趋于稳定。分析原因可能是因为随着酶解时间的延长，细胞结构逐步被打开，酶与底物作用越来越充分，油脂的释放量相应增多，从而得率明显升高；当酶解时间为5～6.5 h时，底物逐渐减少，酶解趋于充分，随着时间继续延长，乳化油部分逐渐增多，使清油的分离受阻，影响油脂分离及品质[24]，从而香柚籽油的得率稍有下降并逐渐趋于稳定。因此，最终选择酶解时间5 h作为提取条件。

2.5 不同CaCl2加入方式对香柚籽油得率的影响

在先添加1.2%纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)培养1 h，再添加1.2%碱性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)酶解4.5 h， 氯化钙与原料比为1∶4加入的条件下，考察不同CaCl2加入方式对香柚籽油得率的影响。由图2可知，CaCl2在一次加入时，得率最大；未添加时得率最低，分批加入和取乳液加入得率较低，分析原因可能是因为过量Ca+能有效地抑制乳状液的形成，有利于游离油的形成，从而得率最好；在酶解期间分批加入 CaCl2，连续添加Ca+会导致乳化剂和稳定剂的总水平降低，从而得率会降低；在酶解期间取乳液加入CaCl2，不能有效地抑制乳状液的形成；未加入CaCl2时，形成的乳状液抑制了得率，从而得率最差。因此，最终选择CaCl2一次加入作为提取条件。

图2 不同CaCl2加入方式对香柚籽油得率的影响

2.6 不同氯化钙与原料比对香柚籽油得率的影响

在先添加1.2%纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)培养1 h，再添加1.2%碱性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)酶解4.5 h，一次加入CaCl2的条件下，考察不同氯化钙与原料比对香柚籽油得率的影响。由图1可知，在氯化钙与原料比为1∶2～1∶4时，随着添加比例的增加，香柚籽油的得率也逐渐增大；在氯化钙与原料比为1∶4～1∶6时，随着添加比例的继续增加，香柚籽油的得率逐渐减少。分析原因可能是因为在低氯化钙与原料比的情况下，反应体系流动性差，不利于酶与底物相互作用；而氯化钙与原料比过高时，较低的酶浓度和底物浓度不利于发挥蛋白酶活性，酶解不充分，从而得率降低[25]。因此，最终选择氯化钙与原料比1∶4作为提取条件。

2.7 响应面法优化实验

2.7.1 响应面实验设计与结果

在单因素实验的基础上，综合显著性差异分析，根据Box-BeHnken响应面设计原理，运用Design Expert 12软件，选择pH(A) 、酶解温度(B) 、酶解时间(C) 、氯化钙与原料比(D) 四个因素为自变量，每个因素设计3个水平，具体因素水平见表1。

表1 香柚籽油氯化钙破乳辅助水酶法提取工艺响应面实验因素水平

每组实验重复3次以估计误差，以得率(Y)为响应值，设计四因素三水平的响应面分析，对工艺参数进行优化，响应面实验设计及结果见表2。

表2 香柚籽油氯化钙破乳辅助水酶法提取工艺响应面实验设计及结果

续表2

2.7.2 模型的建立和显著性分析

利用Design Expert 12软件对所得数据进行回归分析，结果见表3。

表3 香柚籽油氯化钙破乳辅助水酶法提取工艺响应面回归方程模型方差分析

通过对表3数据进行回归分析，可以得到二次多项回归方程为：Y=36.87+0.079 2A-0.006 7B-0.041 7C-0.105 8D+0.015 0AB-0.337 5AC-0.410 0AD-0.062 5BC+0.012 5BD+0.045 0CD-1.52A2-1.21B2-1.35C2-1.61D2。

2.7.3 两因子间交互作用分析

由响应面及等高线结果可知，相对于pH与酶解温度、pH与酶解时间、酶解温度与酶解时间、酶解温度与氯化钙与原料比、酶解时间与氯化钙与原料比的交互作用来说，pH与氯化钙与原料比的交互作用最显著。这与表3中方差分析的结果一致。

由响应面分析结果和表3中F值可以看出，四个因素对香柚籽油得率的影响大小顺序为D(氯化钙与原料比)>A(pH)>B(酶解温度)>C(酶解时间)。

2.7.4 氯化钙破乳辅助水酶法提取江永香柚籽油工艺的确定及验证实验

利用Design Expert 12软件分析得出水酶法提取香柚籽油的最佳工艺为：pH 8.152，酶解温度49.974 ℃，酶解时间4.965 h，氯化钙与原料比为1∶4.474。在此条件下模型预测香柚籽油得率为36.85%。考虑到试验的可行性，将最佳条件调整为：pH 8.0，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h，氯化钙与原料比为1∶4。在此条件下进行3次平行实验，所得香柚籽油得率为37.21%，与理论预测值的相对误差为0.98%，说明该模型给出的工艺参数可靠。

2.8 香柚籽油理化指标分析

2.8.1 香柚籽油过氧化值

过氧化值是评定油脂品质的重要指标之一，反映的是油脂氧化酸败的程度。江永香柚籽油过氧化值为(0.20±0.01) mmol/kg。由此可见，水酶法反应条件温和，对抗氧化物的损伤较少，香柚籽油氧化程度较低，在标准范围内，水酶法提取香柚籽油的品质较好。

2.8.2 香柚籽油酸价

酸价是油脂中游离状态下脂肪酸含量的标志，在日常生活中人们通常用酸价高低作为衡量油脂质量标准之一。江永香柚籽油的酸价为(0.75±0.16)mg/g，在标准范围内，水酶法引起香柚籽油的油脂酸败成度低。

2.8.3 香柚籽油碘价

碘价是评价食用油品质的重要指标。江永香柚籽油的碘价为(111.70±0.05) g/100 g ，在标准范围内，表明该油脂易在体内吸收分解。

2.8.4 香柚籽油皂化值

皂化值是反应脂肪酸分子量大小的指标。江永香柚籽油的皂化值为(188.51±0.05) mg/g，在标准范围内，水酶法提取香柚籽油的脂肪酸平均分子量较小。

2.8.5 香柚籽油脂肪酸组成

江永香柚籽油色泽金黄，澄清透明，具有油脂固有的气味和滋味，并带有柚子的独特香味，感官品质良好。本实验测定的香柚籽油中不饱和脂肪酸达到75.96%，说明江永香柚籽油脂肪酸比例组成较好，适合用于食用油的开发。

3 结论

研究氯化钙破乳辅助水酶法提取江永香柚籽油的工艺条件，采用双酶分步水解，在先添加纤维素酶(50 ℃，pH 6.0)水解1 h后，再按照1∶1的比例进行后续碱性蛋白酶的水解条件的优化，结果发现在pH 8.0、酶添加质量分数1.4%、酶解温度50 ℃、酶解时间5 h、一次加入氯化钙，氯化钙与原料比为1∶4的条件下，香柚籽油得率最高，为37.21%；并对最终提取得到的香柚籽油的酸价、碘价、皂化值、过氧化值进行了测定，均在国家标准限量范围内。综上所述，采用氯化钙破乳辅助水酶法是一种高效、环保的香柚籽油制备工艺，为促进食用油的提取提供了一种快速有效的方法。