用于测定人血浆中37种脂肪酸含量的气相色谱-质谱法前处理方法的优化

钱 映，李艳茹，冯月梅，王松梅，钟读波，殷建忠，3*

(1.昆明医科大学 营养与食品科学系,昆明 650500; 2.云南云测质量检验有限公司,昆明 650000;3.保山中医药高等专科学校,保山 678000)

随着经济全球化推进,人类饮食方式发生快速转变,不健康的饮食行为已成为肥胖、Ⅱ型糖尿病等慢性病的主要发病及死亡因素[1]。膳食脂肪酸(FA)是人体必需的营养成分,其不仅参与生物膜组成[2],还参与调节机体酶活性与炎症过程,在机体能量代谢中发挥重要作用[3]。当摄入过量FA 及FA比例失衡时,可引发机体代谢紊乱,导致肥胖、Ⅱ型糖尿病等疾病[4],且不同构型FA 对机体健康影响也不同[5]。随着营养基因组学日益发展,研究人员还发现FA 会改变机体表观遗传,调节基因表达与代谢反应,进而影响人类某些慢性非传染性疾病(NCD)的易感性[6-7]。为进一步指导流行病学研究[8]及改善人类日常饮食行为,有必要评估个体FA 摄入水平。而现阶段使用的膳食营养调查法存在诸多缺陷,如测量误差较大、难以精准定量等。因此,有必要开发可准确、可靠地反映组织或血液中FA 水平的方法。

目前,总脂肪酸(包括游离脂肪酸和结合脂肪酸)测定方法有气相色谱-质谱法(GC-MS)、附火焰离子化检测器的气相色谱法(FID-GC)和液相色谱-质谱法(LC-MS)。其中,LC-MS溶剂消耗量大、选择性低[9],FID-GC则不能使用稳定同位素反映FA的合成、代谢等过程[10],而GC-MS操作快速、结果稳健[11]。人血浆中单个游离脂肪酸的定性或定量分析方法主要为GC-MS 或LC-MS,其中GC-MS为检测FA 的标准方法,检测效率、准确度及灵敏度均较高[12-13],选择性较好[14],可捕获更多FA 结构信息[11-13,15],且目前已有较健全的FA 鉴定数据库。然而,由于FA 结构的多样性,需要开发精确、有效、检出率高且可全面评估生物样本中FA 种类及含量的方法[16]。但是,在用GC-MS检测实际样品时,其精确度会受诸多条件制约,如提取方法、衍生方法、色谱柱以及内标物等,优化过程冗长复杂。鉴于此,本工作在硫酸催化条件下,依据国家标准GB 5009.168－2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》,确定37种FA 为研究对象,利用甲醇衍生化人血浆中FA,并通过单因素试验和正交试验优化反应条件,GC-MS测定各FA 含量,该方法简单、快速、可检测FA 种类多、检出限低,具有一定实践意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-QP2010 型气相色谱质谱联用仪,配FID;DN-12A 型氮气吹干仪;CT14DII型低速大容量多管架离心机;H1850型台式高速离心机;HCD-1820-1型纯水仪;AR1140/C 型电子天平;HH-3A型数显恒温水浴锅;MVS-1 型涡旋混合仪;SK3300 H 型超声波清洗仪。

37种脂肪酸甲酯混合标准溶液:50 mg·L－1,编号为M20-D。

混合标准溶液系列:取适量37种脂肪酸甲酯混合标准溶液,用正己烷逐级稀释,配制成0.1,0.5,1,5,10,25,50 mg·L－1的混合标准溶液系列。

含0.4 mol·L－1氢氧化钾的甲醇溶液:取0.672 g氢氧化钾,用30 mL甲醇溶解,混匀备用。

含7%(体积分数,下同)硫酸的甲醇溶液:取700μL硫酸,加入10 mL甲醇,混匀备用。

氢氧化钾、硫酸为分析纯;甲醇、正己烷、乙腈为色谱纯;氮气的纯度不小于99.999%;试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 进样条件

溶剂冲洗次数(进样后)2 次;样品冲洗次数2次;高柱塞速率模式,流量10 mL·min－1;黏度补偿时间0.2 s;柱塞进样压力100 kPa;进样速率为高模式。

1.2.2 色谱条件

Rt-2560色谱柱(100 m×0.25 mm,0.2μm);载气为氦气,纯度为99.999%;柱温60℃;进样口温度240 ℃;初始压力500～900 kPa;流量控制方式为压力,压力228.9 kPa,总流量17.3 mL·min－1;柱流量1.3 mL·min－1;线速率22.8 cm·s－1;吹扫流量3 mL·min－1。柱升温程序:初始温度60 ℃,保持5 min;以5 ℃·min－1速率升温至165 ℃,保持1 min;以2 ℃·min－1速率升温至225 ℃,保持27 min,总时间84 min。进样量1μL;分流进样,分流比为10∶1。

1.2.3 质谱条件

电子轰击离子(EI)源;离子源温度230℃,接口温度250 ℃;溶剂延迟时间3 min;采集方式为选择离子监测。

其他质谱参数如表1所示。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

表1(续)

1.3 试验方法

在文献[17-19]的基础上进行试验。从－80 ℃冰箱中取出人血浆样品,在4 ℃冰箱中融化。分取100μL,加入500μL含0.4 mol·L－1氢氧化钾的甲醇溶液,涡旋30 s,室温放置10 min。加入2 mL正己烷,以5 000 r·min－1转速离心5 min。上清液转移至离心管中,加入含7%硫酸(催化剂)的甲醇溶液1 mL,吹氮至干,加入200μL水,于65℃水浴锅中反应20 min。冷却至室温,加入2 mL正己烷,分取上层清液约1 mL,按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验优化催化反应条件

以血浆样品中C14:0、C16:0、C16:1 n－7、C18:0、C18:1 n－9t、C18:2 n－6c、C18:3 n－3等7种最具代表性FA 为待测对象,考察和FA 甲酯化有关的3种因素[催化剂(硫酸)体积分数、反应时间及反应温度]对7种FA 含量的影响。

2.1.1 硫酸体积分数

适当浓度水平的催化剂可缩短反应时间,提高反应效率。试验比较了硫酸体积分数分别为1%,4%,7%,10%,13%时的检测结果,如图1所示。

由图1可知:各FA 含量随硫酸体积分数的增大先增大后减小;当硫酸体积分数为7%时,血浆中各FA 含量较大。因此,试验选择硫酸的体积分数为7%。

图1 硫酸体积分数对血浆样品中7种FA 含量的影响Fig.1 Effect of volume fraction of sulfuric acid on the content of the 7 FAs in plasma sample

2.1.2 反应时间

反应时间的选择很重要,时间过长或过短均会影响血浆中FA 甲酯化的程度。试验比较了反应时间分别为20,30,60,90 min时的检测结果,如图2所示。

图2 反应时间对血浆样品中7种FA 含量的影响Fig.2 Effect of reaction time on the content of the 7 FAs in plasma sample

由图2可知:各FA 含量随着反应时间的延长先增加后降低,最后趋于平缓;当反应时间为30 min时,各FA 含量较大。因此,试验选择的反应时间为30 min。

2.1.3 反应温度

反应温度会影响血浆样品中FA 甲酯化的反应速率、反应时间以及FA 转化率。试验比较了反应温度分别为40,50,60,70,80 ℃时的检测结果,如图3所示。

图3 反应温度对血浆样品中7种FA 含量的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on the content of the 7 FAs in plasma sample

由图3可知:随反应温度的升高,各FA 含量先降低或变化不大;当反应温度为70 ℃时,各FA 含量较大;反应温度继续升高,各FA 含量逐渐降低。因此,试验选择的反应温度为70 ℃。

2.2 正交试验优化催化反应条件

为进一步优化反应条件,设计硫酸体积分数(A)、反应时间(B)、反应温度(C)、空白(D)四因素三水平L9(34)正交试验,正交试验因素水平如表2所示,以上述7种FA 的总含量评价结果,正交试验设计及结果如表3所示。

表2 正交试验因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交试验设计及结果Tab.3 Design and results of orthogonal experiment

表3(续)

结合R值可知,对FA 总含量影响程度从大到小的因素分别为反应温度、硫酸体积分数和反应时间;结合K值可知,A2B1C1为正交试验最佳条件的组合,即硫酸体积分数为7%、反应时间为20 min、反应温度为65 ℃。用此条件进行试验,所得7种FA总质量浓度为119.859 mg·L－1,高于表3中的最大值(118.941 mg·L－1),说明所选条件较优。

用方差分析进一步验证正交试验结果的有效性,当自由度为2、置信度为95%时,因素A、B、C所得F值为12.665,2.735,25.966,影响程度排序和正交试验的一致,其中因素C 的F值大于临界值(19.000),说明该因素具有显著性影响。

在优化的试验条件下,37种脂肪酸甲酯混合标准溶液的色谱图如图4所示。

图4 混合标准溶液的色谱图Fig.4 Chromatogram of the mixed standard solution

2.3 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件对37种脂肪酸甲酯混合标准溶液系列进行测定,以各FA 质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,各FA 标准曲线的线性范围均为0.1～50 mg·L－1,其他线性参数如表4所示。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得结果如表4所示。

表4 线性参数和检出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

表4(续)

2.4 精密度和回收试验

将质控样品(FA 检出种类见表5)在1 d内重复测定5次,确定该方法的日内精密度;连续测定5 d,确定该方法的日间精密度,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果如表5所示。

由表5可知,FA测定值的RSD 为0.27%～6.2%(日内)和0.91%～8.7%(日间),均低于10%,说明该方法精密度较好。

表5 精密度试验结果(n=5)Tab.5 Results of test for precision(n=5)

依据实际血浆样品FA 的质量浓度范围(1～10 mg·L－1),按照试验方法对血浆质控样品进行3个具代表性浓度水平(1,5,10 mg·L－1)的加标回收试验,计算回收率,结果如表6所示。

表6 回收试验结果Tab.6 Results of test for recovery

由表6可知,质控样品中共检测出17种FA,FA 回收率为80.0%～118%,说明该方法准确度较高。

2.5 样品分析

按照试验方法测定云南4个特有少数民族哈尼族、纳西族、布朗族和佤族共1 913个血浆样品(包括正常组和肥胖组)中各FA 含量,用于探讨这些少数民族人群肥胖发生与血浆中FA 的关系。结果显示:4个特有少数民族肥胖组血浆中FA 含量水平均高于正常组;FA 种类及含量在不同民族间的分布存在差异,其中纳西族血浆中FA 总含量最高,而哈尼族血浆中的最低,C16:0、C20:3 n－6可能分别是哈尼族、佤族人群肥胖发生的危险因素,而C18:0可能是纳西族人群肥胖防控的保护因素[20]。

本工作通过单因素试验和正交试验优化了GCMS测定人血浆中FA 含量时前处理过程中的催化条件,并确定最优催化条件:催化剂硫酸体积分数为7%,反应温度为65 ℃,反应时间为20 min。以此条件可完成37种FA 的分离和测定,并成功应用于实际样品的分析。该方法分离度高、精密度和准确度好,可为GC-MS检测人体血浆中FA提供方法参考。