硼上调皖西白鹅产蛋期卵巢IGFBP3、DRD2和CDK1基因表达

赵春芳， 金吉雄， 张梦玲， 叶园园， 隋兰伟，韩玉皎， 任 曼， 靳二辉,2， 李升和*

(1.安徽科技学院 动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽 凤阳 233100;2.安徽安丰堂动物药业有限公司，安徽 庐江 231521)

皖西白鹅源于安徽六安,是经过长期的自然选择和人工选育诞生的中国优良鹅种,其具有明显的季节性就巢,这为推广皖西白鹅的养殖造成了一定的难度[1]。改善皖西白鹅的就巢性能有利于该品种的产业化发展,推广皖西白鹅的养殖,提高其市场占有量。硼是一种具有生物活性的微量元素,动物个体可从豆类和饮用水等中获得,饲粮中的营养物质可为畜禽个体提供生理浓度的硼元素[2]。在动物饲料中补充酵母菌,需要更多的硼元素来保证这些生物的生长和生物活性的发挥[3]。饮用水中补充100 mg/L硼对4～6周龄肉鸡的生长性能和免疫器官的发育有积极影响[4]。低剂量的硼可显著提高体外培养的睾丸支持细胞的存活能力[5]。

IGFBP3为胰岛素样生长因子结合蛋白3,是IGFs系统的重要组成成员,是生长和繁殖信号通路的重要节点之一。有研究表明,IGF1参与卵泡的发育调控,是预防卵泡闭锁所必须的,IGF1在颗粒细胞的增殖和分化中起关键作用[6]。IGFBP3是IGFs家族中最为重要的运输载体,可直接与90%以上的受体结合,能够间接调控IGFs的生物学作用[7]。DRD2为多巴胺受体D2,属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族成员,介导的信号通路参与调节细胞分泌和细胞活力[8]。多巴胺受体是结合在膜上的供神经递质多巴胺(DA)识别的位点,依据生化和药理学标准将此受体分为D1和D2两种类型[9]。周期依赖性蛋白激酶CDK,是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该类激酶可以与细胞周期蛋白(cyclin)协同作用,参加细胞周期的调控;CDK可以和cyclin结合形成异二聚体,催化不同的底物发生磷酸化,对细胞周期的不同时段进行调节[10]。本试验通过检测不同硼水平下卵巢组织中这三个就巢相关基因的差异表达情况,为通过饲料营养调控鹅繁殖性能提供更多的数据基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

120只体重相近、健康的一年龄皖西白鹅,由安徽省六安市金安区飞翔皖西白鹅遗传资源保护中心提供。硼酸(纯度>99.5%,硼含量>17.4%)购于国药集团化学试剂有限公司;Trizol试剂购于Gibco公司;EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒购于TransGen公司;SYBR Green购于Invitrogen公司。

1.2 试验设计

120只体重相近、健康的一年龄皖西白鹅随机分为3组,每组40只,其中对照组饲喂基础日粮,试验组基础日粮中添加不同比例的硼元素。因硼的添加量需要用于专利申请,具体添加比例将在专利授权后公布。试验期60 d。试验结束后，采集皖西白鹅的卵巢组织,置于液氮中冷冻。

1.3 总RNA提取

将组织从液氮中取出,放入事先清洗、灭菌并冷冻好的研钵中,放入液氮进行研磨,将组织磨碎并使用Trizol法提取组织的总RNA。为保证实验的准确性和精确性,测定提取的总RNA的浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳法检测其完整性。

1.4 反转录和基因表达水平检测

将总RNA进行反转录,用于基因表达水平的检测。以cDNA为反应模板,SYBR Green为荧光染料,采用实时荧光定量PCR检测不同硼水平下皖西白鹅产蛋期卵巢中IGFBP3、DRD2和CDK1基因的表达情况,其中IGFBP3、DRD2、CDK1和GAPDH基因的引物序列如表1所示。

表1 用于荧光定量PCR的引物序列

1.5 数据处理分析

所有数据的表示形式为平均值±标准误。对试验获得的数据运用SPSS 21.0软件中One-way ANOVA程序进行差异显著性检验,采用Duncan进行多重比较分析,目的基因相对表达量用2-ΔΔCt法进行计算。P<0.05或*表示差异显著,P<0.01或**表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取质量

如图1所示,经检测,提取的总RNA的A260/A280值在2.0左右;利用1.5%凝胶电泳检测RNA的完整性,结果显示RNA的条带比较清晰,其中28S和18S条带较亮,5S条带最暗,说明RNA没有发生降解,质量符合标准。

图1 总RNA电泳图

2.2 IGFBP3基因在卵巢中的表达水平

如图2所示,与对照组相比,基础日粮中添加不同浓度硼均可使IGFBP3基因的表达水平极显著上调(P<0.01)。

图2 卵巢中IGFBP3基因表达水平

2.3 DRD2基因在卵巢中的表达水平

如图3所示,与对照组相比,基础日粮中添加不同浓度硼均会使DRD2基因表达量上调,其中低硼组DRD2基因表达显著上调(P<0.05)。

图3 卵巢中DRD2基因表达水平

2.4 CDK1基因在卵巢中的表达水平

如图4所示,与对照组相比,基础日粮中添加不同浓度硼均会使CDK1基因表达量上调,在一定程度上使细胞周期的进程加快,其中低硼组CDK1基因表达极显著上调(P<0.01),高硼组CDK1基因表达显著上调(P<0.05)。

图4 卵巢中CDK1基因表达水平

3 结论与讨论

有学者对IGFBP3基因的第一个外显子和第一个内含子的部分序列多态位点进行研究,结果表明, 第一个内含子对产蛋和生长发育很可能有一定的促进作用[11-12]。闫晓娟等[13]采用 Western ligand blot 和 Western blot检测卵巢肿瘤患者和卵巢正常的人中IGFBP3和IGFBP2表达水平的差异,结果显示IGFBP3和IGFBP2表达改变可以引起卵巢细胞不同程度的增殖与分化,从而导致IGF-Ⅱ生物学功能发生改变[14]。金崇富等[14-15]研究结果显示,IGFBP3基因可能是影响鸡生长繁殖性状的一个主效基因,或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。固始鸡饲养中利用饮水补硼,结果显示100 mg/L硼添加量能够使鸡的体重和体增重发生显著增加,具有促进生长发育的作用[4]。本试验发现不同含量的硼可以影响IGFBP3基因的表达,表现为使该基因表达上调,推测在饲粮中添加微量元素硼可能通过影响IGFBP3基因的表达,从而影响皖西白鹅的繁殖性能。

下丘脑弓状核中的多巴胺细胞释放多巴胺进入门脉系统,随血流入垂体前叶,垂体前叶和中叶中存在多巴胺D2受体;在垂体前叶,多巴胺与催乳素细胞上的D2受体结合，抑制催乳素基因转录本在转录和转录后水平上的表达[8,16],进而抑制其合成和释放的过程,影响禽类的就巢行为[17-18]。催乳素是参与禽类就巢发生和维持的关键激素[17,19]。在母禽产蛋期,卵泡会通过分泌孕酮和雌二醇,刺激下丘脑中的5-羟色胺神经元和多巴胺神经元分泌5-羟色胺和多巴胺,这两种神经递质通过与腺垂体催乳素细胞上的受体结合促进催乳素的分泌[20-21],而高水平的催乳素可以直接抑制卵巢卵泡的发育和垂体促性腺激素的分泌,使卵巢萎缩,排卵停止,最终停止产蛋,表现出就巢行为[22-23]。

多巴胺受体也存在于外周,在交感神经末梢上的D2受体,可抑制去甲肾上腺素的释放。DRD2基因对中枢神经系统以及肾脏等有着很重要的生理作用,在家禽的相关报道中也多体现在产蛋性能方面。叶峭研究发现,DRD2基因中多个SNP位点的基因型与产蛋量和开产日龄都存在明显差异,该基因与卵泡发育和卵巢癌发生有关,可起到调节激素分泌和生殖行为的作用[24]。本试验中,检测了DRD2在卵巢中的表达,结果显示硼可使DRD2表达上调。随着分子生物学和基因组学的发展,关于禽类就巢性分子遗传基础的研究已经越来越多。大量就巢性内分泌机制的研究表明,除PRL、VIP及VIPR1外,神经递质5-HT和DA都参与了就巢行为的调控。

CDK1基因处于下丘脑-垂体-卵巢调控轴的核心位置,能够整合来自下丘脑和垂体的信号,从而对卵巢和卵泡中的基因表达进行调节[25]。我们前期研究发现,细胞培养液中添加低浓度硼(0.5 mmol/L)可使大鼠睾丸支持细胞周期的S期和G2/M 加快并抑制细胞凋亡,而添加高浓度的硼(40、80 mmol/L)会促进细胞凋亡并将细胞周期阻滞在G0/G1期[5]。本研究发现,日粮添加不同剂量的硼都会使CDK1基因表达上调,该基因的差异表达或许会影响细胞周期进程。

前期研究发现,日粮中添加25 mg/kg硼可提高皖西白鹅饲料转化率[26]。本研究揭示,日粮添加微量元素硼可不同程度地影响IGFBP3、DRD2和CDK1基因的表达,可使3个基因的表达上调。3个基因表达水平的变化可在一定程度上揭示硼影响皖西白鹅繁殖性能分子作用机制。