沙利度胺对阿尔茨海默病秀丽隐杆线虫模型的改善作用及机制

方亚影 阎茹玉 李玉贤 吴宿慧 李寒冰 李根林

关键词沙利度胺;秀丽隐杆线虫;阿尔茨海默病;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常见的渐行性中枢神经系统退行性疾病，患者大脑中普遍呈现脑组织萎缩、老年斑、神经元纤维缠结等病理特征[1]。全球AD患者正逐年递增，目前临床上也缺乏能有效治疗AD的药物[2]。

沙利度胺是一种新型的免疫调节药和抗炎药，可抑制单核细胞和巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α），从而減少淀粉样蛋白的形成;其还能抑制白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6等炎症因子的产生[3]。相关研究发现，上述炎症因子可参与Tau 蛋白的过度磷酸化，加快Tau 蛋白病理形成的过程[4-5]。

Tau 蛋白的病理变化与AD患者认知能力下降有较强的相关性。Tau 蛋白的正常生理功能是与微管蛋白结合，以维持细胞骨架的稳定性[6]。糖原合成激酶3β（glycogensynthase kinase 3β，GSK-3β）是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）的下游底物，其活化后可导致Tau 蛋白过度磷酸化，从而使Tau 蛋白大量沉积并形成缠结，进而破坏神经元的生理功能[7 - 8]。相关研究发现，激活PI3K/Akt途径可改善神经元细胞凋亡[9]。

秀丽隐杆线虫（以下简称“线虫”）因其生命周期短、神经系统结构简单、遗传信息清晰和易于获得大量个体模型等优点，常被用于神经退行性疾病的相关研究[10]。

BR5270 品系线虫体内可表达人源Tau 蛋白，具有加速Tau 蛋白聚集的特点，使其从成年第1 天起就出现明显的神经元功能障碍;BR5271 品系线虫体内表现出抗Tau蛋白聚集的特点，常作为BR5270 品系线虫的对照[11]。

另外，相关研究发现，线虫体内PI3K和Akt 的同源基因是Age-1 和Akt-1[12-13]。基于此，本研究以BR5270 品系线虫为AD模型，研究沙利度胺改善线虫体内Tau 蛋白毒性及提高线虫学习记忆能力的作用及机制，以期为沙利度胺治疗AD提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有HVE-50 型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama 公司），DL-CJ-2ND Ⅰ型洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），LY03-200 型生化培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司），Nano Drop One C2000 型超微量紫外分光光度计、Fresco 21 型低温离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司），Quant Studio 7Flex 型逆转录聚合酶链式反应（PCR）仪（美国AppliedBiosystems 公司），Gel Doc XR+型自动凝胶成像系统（美国Bio Rad公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用主要药品与试剂有沙利度胺片（常州制药厂有限公司，批号19031332，规格50 mg/片），二甲基亚砜（DMSO，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20210415），蛋白胨、琼脂粉（北京奥博星生物技术有限公司，批号分别为20190126、20191030），酵母浸粉（美国Oxoid 公司，批号分别为1267856-03），Trizol 试剂（美国Ambion Life 公司，批号204202），TB GreenTM Premix ExTaqTM Ⅱ、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本Takara 公司，批号分别为RR820A、RR047A）。Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1 基因（钙蛋白酶的同源基因）的引物由深圳华大基因科技有限公司设计并合成（PCR引物序列及扩增产物长度见表1）。其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 动物

线虫（品系包括BR5270、BR5271）均购自美国线虫中心（https：//cgc.umn.edu），大肠埃希菌Escherichia coliOP50 尿嘧啶合成缺陷菌株由北京生命科学研究所董梦秋教授课题组惠赠。

2 方法与结果

2.1 线虫的培养及同期化处理

2.1.1 NGM培养基的制备称取氯化钠0.60 g、蛋白胨0.50 g、琼脂粉3.40 g，加入5 mg/mL 胆固醇溶液200 μL和纯水200 mL，经高压蒸汽灭菌（121 ℃，15 min）后，依次加入浓度均为1 mol/L 的MgSO4溶液和CaCl2溶液各200 μL、1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.0）5 mL，摇匀后倒板，加入100 μL 大肠埃希菌溶液（由于线虫以大肠埃希菌为食，故后续将其称为“食物”）涂布均匀，于37 ℃培养箱中培养8～12 h，备用。

2.1.2 线虫的同期化处理将2 种线虫（BR5270、BR5271 品系）置于含有食物的NGM 培养基上培养（16 ℃条件下）。挑取处于产卵期的线虫于含有食物的NGM培养基上，培养4 h 后，移除线虫，保留虫卵;继续孵育虫卵至产卵期，即得同期化的亲代线虫，再将亲代线虫继续培养至产卵期，保留虫卵，即得同时期的虫卵[14]。

2.2 沙利度胺对BR5270品系线虫的毒性预实验

取BR5270 品系线虫，按“2.1.2”项下方法进行同期化处理后，分为溶剂对照组（1%DMSO）和沙利度胺不同质量浓度组（10、25、50、100 mg/mL），每组20 条，并设个平行。将线虫置于含不同药物的NGM培养基（含食物）上，于16 ℃条件下恒温培养24 h 后，记录各组线虫的死亡数量。结果显示，溶剂对照组和沙利度胺10mg/mL组线虫无死亡;当沙利度胺给药质量浓度增加至25 mg/mL 时开始有线虫死亡，死亡数为（1.67±0.58）条;沙利度胺给药质量浓度为50、100 mg/mL时，线虫死亡数分别为（5.00±1.00）、（17.34±2.52）条。这提示沙利度胺对线虫的毒性随着质量浓度的增加而增强。因此，为了避免线虫毒理学特征的出现，本研究将沙利度胺最大给药质量浓度定为15 mg/mL。

2.3 BR5270 品系线虫的基础慢反应实验

BR5270 品系线虫由于Tau 蛋白的聚集，表现为从成年第1 天开始就运动不协调、运动神经元轴突缺损[11]，因此，通过测定线虫的摆动次数，可探究沙利度胺对BR5270 品系线虫运动能力的影响。按“2.1.2”项下方法将BR5271、BR5270 品系线虫进行同期化处理，然后于16 ℃条件下培养24 h 后，将BR5271 品系线虫作为对照组，BR5270 品系线虫分为空白组（不加药物）和沙利度胺不同质量浓度组（0.5、2.0、6.0、15.0 mg/mL），每組30条，并设3 个平行。将线虫置于含不同药物的NGM培养基（含食物）上，于16 ℃条件下培养至成年（培养5 d）后，测定各组线虫30 s 内的摆动次数[15]。采用GraphPadPrism 8.0.2 统计软件作图，以SPSS 24.0 统计软件分析实验数据，结果用x±s 表示;多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验（方差齐时）或Dunnett’s T3 多重比较（方差不齐），检验水平α=0.05（下同）。结果显示，与空白组比较，对照组与沙利度胺2.0、6.0、15.0 mg/mL组线虫在30 s 内的摆动次数均显著增加（P<0.01）。结果见表2。

2.4 BR5270 品系线虫的寿命实验

BR5270 品系线虫由于Tau 蛋白聚集，其生存时间比BR5271 品系线虫短[11]，10%最大寿命可反映药物对线虫生存时间的影响[16]，因此，通过分析线虫的10%最大寿命和生存率曲线，可探讨沙利度胺是否能延长BR5270品系线虫的寿命。按“2.3”项下方法将BR5271、BR5270品系线虫进行同期化处理及分组、给药，并设3 个平行，于16 ℃条件下进行培养。每隔24 h 观察线虫的生存状态，并记录线虫的死亡数量，直至各组线虫全部死亡，计算各组线虫10%最大寿命[15]。线虫死亡的判断标准：将线虫拾取器用酒精灯烧热后，轻触线虫并观察线虫是否有反应，如果没有反应则判断为死亡[16]。结果显示，与空白组比较，对照组和沙利度胺0.5 mg/mL 组线虫的10%最大寿命显著延长（P<0.01），且两者的生存率曲线也整体高于空白组;沙利度胺其余各组的10%最大寿命差异无统计学意义。后续实验的给药周期比寿命实验短，故将沙利度胺给药质量浓度设置为0.5、2.0、6.0mg/mL。结果见表3、图1。

2.5 BR5270 品系线虫的短期学习记忆能力实验

BR5270 品系线虫的学习指数与短期学习记忆能力呈正相关，因此，通过测定各组BR5270 品系线虫的学习指数，可探究沙利度胺是否能改善BR5270 品系线虫的短期学习记忆能力[17]。按“2.1.2”项下方法将BR5270 品系线虫进行同期化处理，然后将虫卵于16 ℃培养4 d后，分为空白组、溶剂对照组（1%DMSO）、沙利度胺不同质量浓度组（0.5、2.0、6.0 mg/mL），每组800 条，继续培养48 h 后，各组取200 条线虫置于不含食物的NGM培养基上进行趋化性测试（趋化性测定板制备如图2 所示），记录每组线虫训练前的趋化指数（CINaive）[17]。将各组剩余线虫进行短期学习记忆丁酮训练（如图3 所示），再转移至含有食物的NGM固体培养基上进行培养，分别于培养0、0.5、1.5 h 时，每组各取200 条线虫进行趋化性测试，并记录各时间点的趋化指数（CI0 h、CI0.5 h、CI1.5 h），再计算各时间点的学习指数[学习指数=CI0 h-CINaive（或CI0.5 h-CINaive，或CI1.5 h-CINaive）]，实验重复3 次[18]。结果显示，与空白组比较，沙利度胺6.0 mg/mL 组线虫的短期学习指数在培养0、0.5、1.5 h 时均显著升高（P<0.01）;其余给药组该指数差异无统计学意义，详见表4、图4。

2.6 BR5270 品系线虫长期学习记忆能力实验

将BR5270 品系线虫按“2.5”项下方法进行同期化处理和分组（每组1 000 条），培养48 h 后，各组取200 条线虫置于不含食物的NGM培养基上进行趋化性测试（每组平行3 个平板），记录每组线虫训练前的趋化指数（CINaive）。将各组剩余线虫进行长期学习记忆能力丁酮训练（如图5 所示）[17]。最后一次训练完成后，将线虫转移至含食物的NGM培养基上进行培养，分别于培养0、16、24、40 h 时，每组取200 条线虫进行趋化性测试，并记录各时间点的趋化指数（CI0 h、CI16 h、CI24 h、CI40 h），再按“2.5”项下公式计算各时间点的学习指数。结果显示，与空白组比较，沙利度胺6.0 mg/mL 组线虫的长期学习指数在培养0、16 h 时均显著升高（P<0.01）;其余给药组该指数差异无统计学意义，详见表5、图6。

2.7 BR5270 品系线虫体内Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1基因mRNA的表达水平检测

将BR5270 品系线虫按“2.5”项下方法进行同期化处理和分组，继续培养48 h 后，采用低温Trizol 法提取各组线虫的总RNA，再按相应试剂盒说明书方法进行反转录得到cDNA。以cDNA 为模板，进行实时荧光定量PCR 反应。反应体系为：cDNA 模板1 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNase free water 7 μL。反应条件为：95 ℃变性30 s;95 ℃变性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。以actin-1 基因为内参，采用2-ΔΔCt法计算Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1 基因mRNA的表达水平。实验重复3 次。结果显示，与空白组比较，沙利度胺各质量浓度组线虫体内Age-1、Akt-1 基因（沙利度胺0.5、2.0 mg/mL 组除外）的mRNA表达水平均显著升高（P<0.05 或P<0.01），Gsk-3（沙利度胺0.5 mg/mL组除外）、Clp-1 基因的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05 或P<0.01），结果见表6。

3 讨论

本研究使用的BR5270 品系线虫属于Tau 转基因线虫模型，人源Tau 蛋白聚集片段由于K280 基因的缺失增强了Tau 蛋白的聚集倾向，使该品系线虫的毒性急剧增加，表现为从成年第1 天开始就运动不协调、轴突缺损、运动能力严重受损等[11]。BR5271 品系线虫由于具有抗Tau 蛋白聚集的特点，常作为BR5270 品系线虫的对照组[11]。本研究的基础慢反应实验结果显示，沙利度胺可以明显增加BR5270 品系线虫的摆动次数，这提示其可改善线虫因Tau 蛋白聚集而导致的运动能力受损。寿命实验结果显示，低剂量（0.5 mg/mL）的沙利度胺可显著延长BR5270 品系线虫的10%最大寿命，这提示沙利度胺能较好地缓解该品系线虫因Tau 蛋白聚集而导致的毒性作用。

丁酮是一种带有气味的挥发性物质，在缺乏食物时，给予线虫食物并将其暴露于丁酮气味中，线虫会根据丁酮气味寻找食物，因此可将其用来研究线虫的学习记忆能力[18]。一般情况下，对线虫进行长期记忆训练的持续时间应大于16 h，短期记忆训练的持续时间则应小于2 h[19-20]。本研究结果显示，经沙利度胺（6.0 mg/mL）干预后，BR5270 品系线虫短期学习指数和长期学习指数（培养0、16 h 时）均显著升高，长期学习指数（24、40 h）与空白组相比有升高，但无显著性差异，这可能与长期学习记忆能力从培养16 h 后开始下降有关，与Amano等[20]的研究结论一致。这提示沙利度胺可改善BR5270品系线虫短期和长期的学习记忆能力。

过度磷酸化的Tau 蛋白与微管脱离后，可积累形成神经元纤维缠结，从而造成突触结构的可塑性损伤以及神经元的变性和凋亡，进而引发AD[21]。GSK-3β是诱导Tau 蛋白磷酸化的主要蛋白激酶，其在线虫体内的同源基因为Gsk-3[22]。在PI3K/Akt 信号通路中，PI3K（线虫体内的同源基因为Age-1）被激活后可活化Akt（线虫体内的同源基因为Akt-1）的功能，活化后的Akt 又可抑制GSK-3β的活性，进而减少Tau 蛋白的异常磷酸化[23]。本研究结果显示，沙利度胺可显著升高BR5270 品系线虫体内Age-1、Akt-1 基因（0.5、2.0 mg/mL 的沙利度胺除外）mRNA表达水平，显著降低Gsk-3 基因mRNA表达水平（0.5 mg/mL 的沙利度胺除外），这提示沙利度胺可能是通过活化PI3K/Akt 信号通路来减少Tau 蛋白的异常磷酸化。另外有研究发现，Tau 蛋白与突触后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD-95）相互作用后，可使Ca2 +通过N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acidreceptor，NMDA）受体大量流入细胞，从而激活钙蛋白酶并引发线粒体功能障碍，最终诱导神经细胞凋亡[24]。在线虫体内钙蛋白酶的同源基因是Clp-1[25]。本研究结果显示，沙利度胺可显著降低BR5270 品系线虫体内Clp-1 基因mRNA表达水平，这提示沙利度胺可能是通过抑制钙蛋白酶来减轻Tau蛋白诱导的神经细胞凋亡。

综上所述，沙利度胺可改善AD線虫模型的运动障碍，并延长其寿命，增强其学习记忆能力;具体作用机制可能与激活PI3K/Akt 信号通路和抑制蛋白酶有关。本研究结果也初步证实沙利度胺抗AD的作用，可为沙利度胺治疗AD提供实验依据。