人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠神经内分泌免疫网络的调节机制研究

周蓓 朱巧凤 陈誉丹 冯莉婷 刘舒凌 吴燕春

关键词人参;蛤蚧;配伍;肾阳虚;下丘脑-垂体-肾上腺轴;下丘脑-垂体-甲状腺轴;下丘脑-垂体-性腺轴;神经内分泌免疫网络

人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的根和根茎，性微温，味甘、微苦，主归脾、肺、心、肾经，临床常用于治疗久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷等[1]。因其具有强心、免疫增强、抗衰老、抗肿瘤等广泛的药理作用，故具有极高的药用价值[2]。蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧Gekko gecko Linnaeus.的干燥体，性平而味咸，主归肺、肾经，临床常用于治疗虚喘气促、阳痿、遗精等[1]。《本草纲目》曰：“昔人言补可去弱，人参、羊肉之属。蛤蚧补肺气，定喘止渴，功同人参;益阴血，助精扶羸，功同羊肉”。

经典人参蛤蚧补虚药对配伍出自《卫生宝鉴》“人参蛤蚧散”、《医级》“人参蛤蚧丸”、《圣济总录》“独圣饼”等，临床应用历史悠久。古今诸多医家认为蛤蚧配伍人参使用可增强补虚壮阳之效。目前的研究多集中在人参、蛤蚧为君药的复方治疗喘息性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等肺系疾病[3-5]。本课题组前期研究已明确蛤蚧对肿瘤、衰老等均具有实验免疫调节作用，并对肾阳虚动物具有改善作用[6-8]，但蛤蚧配伍人参后，是否能增强其补肾阳作用及相关机制尚未明确。

中药配方颗粒由于质量标准统一，更有利于进行配伍的药效学研究。目前中药配方颗粒的药理作用研究主要集中在抗炎、止痛等中医药优势领域[9]。本研究通过氢化可的松复制肾阳虚模型大鼠，观察人参与蛤蚧配方颗粒配伍应用对模型大鼠的补肾阳作用，并探讨其对模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）轴、下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamuspituitary-thyroid，HPT）轴、下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）轴及免疫功能形成的神经内分泌免疫网络的调节机制，为人参与蛤蚧配方颗粒的临床配伍应用提供科学依据。

1 材料

1.1 主要仪器

SQP 型精密电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;Infinite M200 Pro 型酶标仪购自瑞士Tecan 公司;i2000 型全自动免疫发光分析仪购自美国Abbott 公司;cobas® c 311 型全自动生化分析仪购自德国罗氏诊断有限公司;TGL-16 型低温离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;GeneAmp PCR System9700 型基因扩增仪、ViiATM 7 型实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）系统均购自美国ABI 公司;BX43 型光学显微镜购自奥林巴斯贸易（上海）有限公司。

1.2 主要药物与试剂

人参配方颗粒购自江阴天江药业有限公司（批号20010253，每2.50 g 颗粒相当于饮片10 g）;蛤蚧配方颗粒购自深圳华润三九医药股份有限公司（批号1903001C，每2.99 g 颗粒相当于饮片20 g）;金匮肾气丸购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂（批号1803280，规格360 丸）;氢化可的松注射液购自百正药业股份有限公司（批号1908003，规格10 mg ∶2 mL）;环磷酸腺苷（serum cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、环磷酸鸟苷（guanosine cyclic phosphate，cGMP）、促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮质醇（cortisol，CORT）、睾酮（testosterone，T）的大鼠酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（批号分别为LY2B9CTRRR、6P6TK8JK57、N3VIFVDNRX、3H9J32UP81、512AVRZZQT、9DVDF6-2B98）;三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲状腺素（thyroxine，T4）、雌二醇（estradiol，E2）的放射免疫分析试剂盒均购自意大利DiaSorin 公司（批号分别为201946、201913B、RE34872）;鼠源IgG、IgM 试剂盒均购自德国罗氏诊断有限公司（批号分别为38451501、35257501）;Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司（批号15596026）;苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（批号G1120）;Gold View染料购自上海赛百胜基因技术有限公司（批号HGV-Ⅱ）;RNA 酶抑制剂、SuperScriptTM Ⅲ 反转录酶购自美国Epicentre 公司（批号分别为SRI6310K、RF910100）;2×PCR MasterMix 核酸扩增试剂购自美国Arraystar 公司（批号AS-MR-006-25）。

1.3 动物

48 只雄性SPF 级SD 大鼠，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。本研究经广西中医药大学伦理委员会审核通過（批准号DW20190106-003）。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

大鼠适应性喂养1 周，根据体质量按随机数字表法分为正常组、模型组、金匮肾气丸组（阳性对照）、人参组、蛤蚧组、配伍组，每组8 只。除正常组外，其余组大鼠每天后腿肌内注射氢化可的松25 mg/kg，连续15 d 进行造模，根据参考文献[10]判断造模是否成功;正常组同期肌内注射等体积生理盐水。造模成功后，对各组大鼠进行灌胃。金匮肾气丸组灌胃剂量为2.33 g/kg，临用时用生理盐水配制。人参、蛤蚧按照配方颗粒量/饮片量比例、人体质量60 kg 换算，并参照人与大鼠体表面积折算的等效剂量比值换算[11]，临用时用生理盐水溶解，37 ℃水浴搅拌5 min，配制混悬液。人参组灌胃剂量为0.53g/kg（临床等效剂量的2 倍），蛤蚧组灌胃剂量为0.21g/kg（临床等效剂量的2 倍），配伍组灌胃剂量为人参配方颗粒0.53 g/kg 和蛤蚧配方颗粒0.21 g/kg。模型组和正常组灌胃等体积生理盐水。所有大鼠灌胃体积均为10 mL/kg，每日1次，共灌胃28 d。

2.2 大鼠体质量、肛温测定

分别于灌胃前和灌胃第7、14、21、28 天，采用电子天平测定大鼠体质量，采用电子体温计测定大鼠肛温。

2.3 取材与处理

灌胃28 d 后，大鼠禁食不禁水12 h，然后以水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。血样以3 000 r/min 于4 ℃离心10 min，取上清液于-80 ℃保存。腹主动脉取血后，在冰上将大鼠左右肾上腺、甲状腺、左右睾丸完整剪下，生理盐水洗净，置于4%甲醛溶液中固定。在冰下摘取大鼠下丘脑，置于冻存管在-80 ℃保存待测。

2.4 大鼠血清cAMP、cGMP水平检测

采用ELISA 法检测。根据“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。按相应试剂盒说明书方法检测大鼠血清cAMP、cGMP 水平并计算cAMP/cGMP。

2.5 大鼠HPA 轴（CRH、ACTH、CORT）、HPT 轴（T3、

T4）、HPG轴（T、E2）、免疫（IgG、IgM）相关指标检测根據“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。采用ELISA法，按相应试剂盒说明书检测大鼠血清CRH、ACTH、CORT、T 水平。采用放射免疫法，按相应试剂盒说明书检测T3、T4、E2水平。采用免疫比浊法，按相应试剂盒说明书检测IgG、IgM水平。根据检测结果计算T/E2。

2.6 大鼠肾上腺、甲状腺、睾丸组织病理形态学观察

根据“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。肾上腺、甲状腺、睾丸组织用4%甲醛溶液固定，再进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、乙醇梯度脱蜡、HE染色，采用光学显微镜观察组织病理形态学变化并拍照。

2.7 大鼠下丘脑CRH、TRH、GnRH mRNA 表达水平检测

采用qRT-PCR 法检测。根据“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取材与处理。取-80 ℃冻存的下丘脑（每组取3 只小鼠样本），先用Trizol 提取总RNA，反转录成cDNA后行PCR 扩增，用以检测CRH、促甲状腺激素释放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）、促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRh）mRNA表达水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及产物长度见表1。

2.8 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠体质量、肛温的影响

与正常组比较，模型组大鼠体质量在不同时点均显著降低（P<0.01）。各给药组大鼠灌胃前体质量差异无统计学意义（P>0.05）;灌胃第7、14、21、28 天，各给药组大鼠体质量均有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。与配伍组比较，人参组、蛤蚧组大鼠体质量在不同时点的差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

与正常组比较，模型组大鼠肛温在各时点均显著下降（P<0.05 或P<0.01）。各给药组大鼠灌胃前肛温差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，配伍组大鼠肛温在灌胃第7、14、21、28 天均显著升高（P<0.05 或P<0.01）。与配伍组比较，人参组、蛤蚧组大鼠肛温在灌胃第7 天均显著降低（P<0.05），蛤蚧组大鼠肛温在灌胃第14、21 天均显著降低（P<0.05）。这说明人参与蛤蚧配方颗粒配伍对升高肾阳虚模型大鼠肛温具有一定的协同作用。结果见表3。

3.2 人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影响与正常组比较，模型组大鼠cAMP 水平、cAMP/cGMP 显著降低（P<0.01），cGMP 水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠cAMP 水平、cAMP/cGMP 显著升高（P<0.05 或P<0.01），cGMP 水平显著降低（P<0.01）。与配伍组比较，人参组、蛤蚧组大鼠cAMP 水平、cAMP/cGMP 有降低趋势，cGMP 水平有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表4。

3.3 人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠HPA轴、HPT轴、HPG轴、免疫相关指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4、T 水平和T/E2均显著降低，E2、IgG、IgG 水平均显著升高（P<0.05 或P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠CRH、ACTH、CORT、T3 水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），金匮肾气丸组、配伍组大鼠T 水平、T/E2均显著升高（P<0.05 或P<0.01），人参组、配伍组大鼠E2水平均显著降低（P<0.05），配伍组大鼠IgG 水平显著降低（P<0.05）。与配伍组比较，人参组、蛤蚧组大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4水平差异无统计学意义（P>0.05），金匮肾气丸组T4 水平显著升高（P<0.01），人参组、蛤蚧组大鼠T/E2显著降低（P<0.05 或P<0.01）。这说明人参与蛤蚧配方颗粒配伍对升高肾阳虚大鼠T/E2比值有一定协同作用。结果见表5。

3.4 人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠肾上腺、甲状腺、睾丸组织病理形态学的影响

与正常组比较，模型组大鼠可见肾上腺组织皮质细胞分层不清晰，细胞排列不规则、体积缩小，束状带变窄，细胞呈空泡样改变;甲状腺组织滤泡大部分上皮细胞被破坏，细胞核减少，组织紊乱，部分滤泡胶质缺失，可见明显病理性损伤;睾丸组织生精小管排列略松散、间隙略变大，部分生精细胞排列紊乱，部分有初级精母细胞固缩、精子细胞质消失现象，有轻微病理性损伤。与模型组比较，各给药组大鼠肾上腺、甲状腺、睾丸组织的病理性损伤均有所改善。结果见图1。

3.5 人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠下丘脑CRH、TRH、GnRH mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠下丘脑CRH mRNA表达水平显著升高，TRH、GnRH mRNA表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠下丘脑CRH mRNA表达水平均显著降低，TRH、GnRH mRNA表达水平均显著升高（P<0.01）。与配伍组比较，金匮肾气丸组CRH、GnRH 和蛤蚧组CRH mRNA 表达水平均显著升高（P<0.01）。这说明人参与蛤蚧配方颗粒配伍对降低肾阳虚模型大鼠下丘脑CRH mRNA表达有一定的协同作用。结果见图2。

4 讨论

肾阳虚是中医研究的热点。沈自尹院士多年研究得出肾阳虚证具有下丘脑-垂体-靶腺轴（包括HPA轴、HPT轴、HPG軸）不同水平、不同程度的功能紊乱，也与免疫功能形成的神经内分泌免疫网络相关[12]。神经内分泌免疫网络学说将神经、内分泌、免疫三大系统相互间的调节关系作为动态性整体进行全面系统研究，并以细胞因子、激素、神经递质作为信息分子来实现人体整体功能的调控[13]。

中医认为肾是先天之本，肾阳乃一身阳气之根本。肾阳虚是中医临床基本证型之一。肾阳虚证有畏寒肢冷、腰膝酸痛、男子遗精、女子带下清稀等临床症状。外源性糖皮质激素复制大鼠肾阳虚模型是目前比较经典、应用最广的模型。本研究造模后大鼠出现体质量、肛温下降。研究表明，肾阳虚的评价指标包括cAMP、cGMP水平及cAMP/cGMP[10]。本研究中模型组大鼠cAMP水平、cAMP/cGMP 显著降低，cGMP 水平显著升高，表明肾阳虚动物模型构建成功。

本研究复制大鼠肾阳虚模型是利用外源性糖皮质激素抑制ACTH的释放，使肾上腺萎缩、肾上腺皮质分泌类固醇激素减少，能真实模拟HPA轴受抑制时的病理状态，而HPT 轴、HPG 轴受干扰相对不明显[12]。血清CRH、ACTH、糖皮质激素（主要为CORT）为HPA轴参与控制应激反应的激素。同时，糖皮质激素升高也会造成HPA轴负反馈作用减弱，下丘脑CRH mRNA表达水平升高[14]。本研究结果显示，造模后大鼠HPA轴功能被抑制，表现为血清CORT、CRH、ACTH水平降低，这与以往文献报道一致[15-16];人参与蛤蚧配方颗粒配伍灌胃能显著升高大鼠血清CRH、ACTH、CORT 水平，而显著降低下丘脑CRH mRNA表达水平，且对下丘脑CRH mRNA表达的影响效果优于阳性对照药金匮肾气丸，同时改善肾上腺组织的病理损伤。这提示人参与蛤蚧配方颗粒配伍能有效改善HPA轴功能紊乱及病理损伤。HPT轴功能抑制与T3、T4分泌紊乱有关，T3是诊断甲状腺功能亢进症的特异性指标，T4是甲状腺分泌最丰富的激素，而临床上肾阳虚者通常表现为甲状腺功能降低[17]。本研究结果显示，外源性糖皮质激素复制肾阳虚模型大鼠的T3、T4水平和下丘脑TRH mRNA表达水平显著降低，这与以往文献报道一致[18-20];人参与蛤蚧配方颗粒配伍灌胃后，大鼠T3水平显著升高，T4水平有升高趋势，而阳性对照药金匮肾气丸对T4水平升高更有优势。此外，人参与蛤蚧配方颗粒配伍后还能显著升高下丘脑TRHmRNA表达水平，同时改善甲状腺组织的病理损伤。这提示人参与蛤蚧配方颗粒配伍能改善HPT轴功能紊乱及病理损伤。E2、T 为性激素，与HPG 轴生殖器官发育相关。肾阳虚造模后动物往往表现为卵巢、睾丸功能不足或衰退，性激素水平紊乱[10]。本研究结果显示，外源性糖皮质激素复制肾阳虚模型导致大鼠T 水平和下丘脑GnRH mRNA表达水平显著降低、E2水平显著升高，这与以往文献报道一致[21-22];人参与蛤蚧配方颗粒配伍灌胃能显著升高大鼠T水平、E2/T、下丘脑GnRH mRNA表达水平，显著降低E2水平，同时改善睾丸组织的病理损伤。这提示人参与蛤蚧配方颗粒配伍能改善HPG轴功能紊乱及病理损伤。

“正气存内，邪不可干”，正气的产生离不开肾阳温煦，故肾与免疫具有密切关系。免疫球蛋白是重要的免疫分子，IgG、IgM 水平升高也是外源性糖皮质激素复制大鼠肾阳虚模型后免疫功能紊乱的表现[23]。本研究结果显示，肾阳虚造模后大鼠IgG、IgM 水平升高;人参与蛤蚧配方颗粒配伍灌胃可在一定程度上降低两者水平，使之恢复至免疫蛋白分泌正常。这说明人参与蛤蚧配方颗粒配伍能在一定程度上改善免疫系统功能紊乱。

综上所述，人参与蛤蚧配方颗粒配伍应用对肾阳虚模型大鼠具有协同调节作用，其机制可能与调节HPA轴、HPT轴、HPG轴及免疫功能形成的神经内分泌免疫网络有关;且人参与蛤蚧配方颗粒配伍对提高肾阳虚模型大鼠肛温、T/E2，降低下丘脑CRH mRNA表达水平等的效果优于单用人参或蛤蚧配方颗粒。笔者团队下一步拟对人参、蛤蚧配方颗粒的不同配伍比例进行研究。