基于SG2快速分离胶搭建法医遗传分析快检平台

李英 俞丽娟 丰华 李泽伦 公安部第一研究所

引言

DNA 检测技术有“新一代证据之王”的美誉。在刑侦案件侦破中，该技术有着广泛的运用。随着DNA检测技术的不断发展和革新，提高DNA检测准确率的同时，也不断推出了快速DNA检测方案，如国外推出的RapidHIT 200和ANDE 6C DNA快速检测平台，两款平台都是基于微流控芯片和毛细管电泳检测技术，集DNA 提取、扩增、电泳和分析四大功能于一体，实现样品快速自动化检测，降低污染风险且大幅缩短了检验时间，可应用于重大案件现场的快速排查[1]。但上述两款快检平台虽然能够大幅度缩短DNA检测时间，但在检测通量、检测精度、试剂的适用性、数据的可靠性、耗材的昂贵性等方面仍与传统的毛细管电泳遗传分析仪存在很大差距，限制了在国内法医DNA领域的广泛应用。

国外的DNA快检设备或传统的毛细管电泳遗传分析仪，都是基于凝胶的分子筛效应，在高压电场作用下将长度不同的DNA片段得到有效的分离。如果为了缩短电泳时间，可以施加更高的电压，但会带来电泳通道温度过高等不利影响。因此，本文通过自主研制的SG2快速分离胶和GA118-24B遗传分析仪、SureID S6人类DNA身份鉴定试剂盒搭建法医DNA快检平台，可大幅度缩短传统毛细管电泳遗传分析仪的检测时间，为DNA实验室实现快速检测提供了解决方案。

一、基于SG2快速分离胶搭建法医DNA快检平台

（一）系统组成

法医DNA快检平台由GA118-24B遗传分析仪，SG2快速分离胶、SureID S6人类DNA身份鉴定试剂盒构成，其余缓冲液、甲酰胺、毛细管等均为GA118-24B遗传分析仪的配套试剂耗材。

凝胶作为毛细管电泳分离基质，电泳过程中动态涂覆于毛细管内壁上，有效控制电渗流的同时，其分子筛效应可对DNA片段进行有效分离。SG2快速分离胶由N-二甲基丙烯酰胺（PDMA）和缓冲液（尿素、TAPS缓冲液等）组成，高分子聚合物PDMA作为筛分介质，其分子量大小影响毛细管电泳的分离效率和片段读长，分子量越高分离效果越好，有利于大片段DNA的分离，反之则有利于小片段DNA的分离[2]。SG2快速分离胶通过合理控制PDMA分子量大小，在保证大片段高分辨率的同时尽可能的提升DNA片段的迁移速度[3]，大幅度提高了DNA电泳检测速度、缩短DNA电泳时间。

SureID S6是国内第一款固体扩增试剂，采用六色荧光技术，复合扩增23个基因座，包含21个常染色体基因座，1个性别标记基因座Amelogenin及1个Y染色体基因座DYS391，最大片段不超过400bp，满足法庭科学现场检材检验需求，操作简单，性能强大，鉴于其含有15个小于250bp的基因座，可提高降解DNA模板中数据信息的获取，扩增时间不超过90分钟，在实际案件中应用效果良好，本文搭建的DNA快检平台选用该试剂盒作为扩增试剂。

GA118-24B遗传分析仪是一所自主研制的新一代全自动多通道基因操作平台。在传统毛细管电泳仪基础上，实现了业内首创八色以上荧光检测技术，国内首台可同时检测24个样品的高通量平台，设备所有零部件全部实现国产化，极大地降低了设备的使用成本。

（二）电泳参数

毛细管电泳遗传分析仪的检测时间主要分为三部分：恒温箱升温时间、电泳数据采集时间和其他部件运行时间，恒温箱需要从室温升至60℃以保证凝胶的最佳分辨率和数据重现性，数据采集时间用来采集电泳时所有DNA片段经过检测窗口的荧光信息。GA118-24B的整个电泳过程需要约40分钟，其中数据采集时间为1500s，占整个检测时间的60%以上，DNA快检平台由于采用了SG2快速分离胶和SureID S6扩增试剂盒，利用SG2能够大幅度提升DNA片段电泳速度和SureID S6最大片段不超过400bp的优势，能够大幅度缩短电泳时间，数据采集时间可以减少到800s，保证所有小于500bp的DNA片段荧光信息在这个时间内都能够被采集到[4]，DNA快检平台在GA118-24B上建立的运行模型参数如图1所示。

二、实验测试结果

（一）电泳时间

按DNA快检平台电泳参数设置，将96个样本（含ladder、内标及9948阳性对照）在GA118-24B上进行连续电泳，采用GeneMapperTMID-X分析软件对数据进行分析，每个样本中的最大长度内标500bp片段出峰时间在600-700s内，如图2所示为一组24个样本的500bp片段出峰时间，数据采集时间减少到800s完全可以满足SureID S6试剂盒的检测要求。

（二）分型准确性

对上述测试的96个样本中的5个基因分型对照物ladder 和10个9948阳性对照样本进行分析，5个Ladder中的23个基因座、10个9948阳性对照样本均分型准确，结果与试剂盒说明书中的给定结果完全一致，如图3、图4所示。

（三）分辨率

对5个Ladder中D1S1656基因座的4个等位基因15.3、16、16.3、17两组相差1bp的DNA片段进行分析，均能够被正确分辨识别，如图5所示，两个相差1bp的等位基因峰高3000rfu，分离点峰高为1600rfu，能够被软件正确识别。

（四）重复性

随机选取5个9948阳性对照样本，对D8S1179的等位基因12、13进行分析，如图6所示，5个样本的片段长度误差均小于0.5bp，分型准确，峰形尖锐，峰高均衡，具有高度的重复性和一致性。

三、讨论

（一）基于SG2快速分离胶的法医遗传分析快检平台的适应性

在SG2快速分离胶DNA快检平台通过SureID S6试剂盒的验证后，利用该平台对目前国内外主流扩增试剂进行了初步测试，测试试剂盒包括：公安部物证鉴定中心的Typer19，阅微基因的M28A，华大基因的炎黄34、YDB，AB公司的ID Plus、VFP，Promega公司的PP21等7个试剂盒，均顺利通过平台测试，大幅度减少电泳时间10分钟以上，测试结果见图7～13。

（二）大幅度缩短DNA检测时间、提高DNA检测效率

采用上述DNA快检平台，第一次电泳时需要的时间包括恒温箱升温时间15分钟，数据采集时间13分钟，其他部件运行时间2分钟，合计检测时间30分钟，连续检测时恒温箱已处于60℃不需要升温，每次电泳检测时间仅需15分钟，检测通量可达到72个样本/小时，日检测2304个样本，可大幅度提高DNA实验室的检测能力。

（三）仪器、试剂、耗材的全面配套

SG2快速分离胶与GA118-24B遗传分析仪和SureID X S6试剂盒搭建的法医DNA快检平台，在数据采集时间上比传统凝胶电泳节约10分钟以上。SG2快速分离胶也可用于GA118系列其他检测平台，对国内外其他主流扩增试剂进行检测，同时电泳检测所采用的毛细管阵列、缓冲液、甲酰胺等试剂耗材也实现了全面配套。