健脾止动汤对慢性束缚应激抽动障碍大鼠前额叶皮质神经元及神经营养因子的影响

白雪 张宏贤 周倩倩 马宁 闫文宏 张晶晶 崔霞

抽动障碍是儿童时期常见的一种慢性神经精神障碍性疾病。在中国，学龄期儿童抽动障碍的患病率已达到6.1%，近年来其患病率呈明显上升趋势[1]。中药因其较好的疗效和安全性在抽动障碍的治疗方面发挥着积极的作用。健脾止动汤是国家名老中医药专家王素梅教授的经验处方，在临床上取得了确切的疗效[2]，于2015年获得国家专利(专利号：CN201510198368.8)。

抽动障碍属于神经发育障碍性疾病，其发生可能与神经元的生长及分化、突触的生长及修剪等有关。课题组前期发现抽动障碍存在谷氨酸系统功能亢进[3]，而谷氨酸的高表达在脑发育的后期或病理状态下表现为神经毒性，对神经元存在较强的破坏性，而神经营养因子在神经发育中起着重要作用[4]。故本研究采用IDPN腹腔注射联合慢性束缚应激因素制备慢性束缚应激抽动障碍大鼠模型[5]，观察健脾止动汤对模型大鼠前额叶皮质区神经元及神经营养因子水平的影响，为进一步研究健脾止动汤治疗抽动障碍的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境

健康离乳3周龄雄性SD大鼠48只，体质量40～60 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。分笼适应性饲养5天，自由饮食，温度(22±2)℃，相对湿度40～70%，于中日友好医院临床医学研究所实验动物中心饲养。

1.2 实验药物

健脾止动汤配方颗粒(太子参10 g、钩藤10 g、茯苓10 g、炒白术10 g、半夏6 g、陈皮6 g、川芎6 g、龙胆草3 g、当归10 g、防风6 g，购自北京中医药大学第三附属医院颗粒药房，由北京康仁堂药业有限公司提供)，配成溶液(1 mL药液中约含1.6 g生药)，4℃冰箱存用；盐酸硫必利片(泰必利，规格：100 mg，江苏恩华药业股份有限公司，批号：20191208)，用生理盐水配成混悬液(1 mL药液中约含有2.1 mg原药)。

1.3 主要实验试剂与仪器

IDPN[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：317306]；大鼠脑源性神经营养因子(Rat BDNF)酶联免疫试剂盒(批号：20200719.60239R)、大鼠神经生长因子(Rat NGF)酶联免疫试剂盒(批号：20200719.60150R)、大鼠胰岛素样生长因子-1(Rat IGF-1)酶联免疫试剂盒(批号：20200719.60059R)，总蛋白试剂盒(批号：20211230.30002)，均购于北京瑞格博科技发展有限公司。尼氏(Nissl)染液(甲苯胺蓝法)(上海源叶生物科技有限公司，货号：R30434)；Unicel DxC 600 Synchron 全自动生化分析仪(美国Beckmancoulter)。

1.4 动物分组及造模

SD大鼠适应性喂养5天后，按体质量随机分为空白组12只和造模组36只。空白组予腹腔注射生理盐水1 mL/(100 g·d)，每日1次，连续7天；造模组予腹腔注射IDPN[250 mg/kg，1 mL/(100 g·d)]，每日1次，连续7天。同时予慢性束缚法造模，将大鼠放置于束缚装置中，每日连续束缚3小时(8:00-11:00 am)，连续21天。束缚期间造模组及空白组大鼠均禁食水。第22天进行刻板运动、旷场实验等行为学检测，造模组表现出啮齿类动物刻板行为的典型特征，如旋转运动、头部垂直或水平方向运动，表示模型诱导成功。根据刻板运动评分及旷场实验评分结果，将造模成功的模型大鼠随机分为模型组、硫必利组、健脾止动汤组各12只。

1.5 给药方法

造模第23天开始给药，空白组及模型组予生理盐水灌胃，硫必利组予盐酸硫必利混悬液灌胃(1 mL药液中约含2.1 mg原药)，健脾止动汤组予健脾止动汤溶液灌胃(1 mL药液中约含1.6 g生药)，均按1 mL/(100 g·d)灌胃，每日1次，连续4周。

1.6 指标检测

末次用药后，每组各随机选取5只大鼠断头取脑，4%多聚甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，制成6 μm的石蜡切片，进行尼氏染色。利用Lecia图文分析系统在高倍显微镜下观察皮质区神经元细胞及尼氏小体形态结构及数目的变化。

末次用药后，每组各随机选取7只大鼠断头取脑，在冰盒上迅速剥离大鼠前额叶皮质，置于冻存管中，液氮冻存后，存放于-80℃冰箱中，以待检测。严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测，用酶标仪以450 nm波长检测其吸光度值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 健脾止动汤对慢性束缚应激抽动障碍大鼠前额叶皮质区神经元尼氏小体的影响

尼氏染色结果显示，空白组前额叶皮质区神经元结构正常，排列紧密，胞浆中尼氏小体丰富，可见蓝紫色斑块状尼氏小体。与空白组相比，模型组神经元排列稀疏，细胞间隙增大，胞浆内尼氏小体表达减弱，颜色变浅，部分明显溶解、消失，数量明显减少(P<0.05)；与模型组相比，硫必利组神经元排列相对紧密，细胞间隙略减少，胞浆内尼氏小体表达略增强，颜色稍有加深，数量略增多(P>0.05)，健脾止动汤组神经元排列紧密，细胞间隙减小，胞浆内尼氏小体表达丰富，颜色加深，数量明显增多(P<0.05)。见图1、表1。

图1 各组慢性束缚应激抽动障碍大鼠前额叶皮质神经元尼氏小体表达情况(尼氏染色，×400)

表1 各组慢性束缚应激抽动障碍大鼠前额叶皮质神经元尼氏小体表达情况

2.2 健脾止动汤对慢性束缚应激抽动障碍大鼠前额叶皮质区神经营养因子的影响

与空白组大鼠相比，模型组大鼠皮质中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)含量有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，硫必利组大鼠皮质中BDNF含量有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，健脾止动汤组大鼠皮质中BDNF含量显著升高(P<0.05)。与空白组相比，模型组大鼠皮质中胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)含量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，硫必利组、健脾止动汤组大鼠皮质中IGF-1含量显著升高(P<0.05)。与空白组相比，模型组大鼠皮质中神经生长因子(nerve growth factor，NGF)含量升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，健脾止动汤组大鼠皮质中NGF含量显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组慢性束缚应激抽动障碍大鼠前额叶皮质神经营养因子表达情况

3 讨论

抽动障碍在中医古籍中没有相应的病名，但根据其症状特点，可归于“肝风”“瘛瘲”“慢惊风”的范畴。健脾止动汤是王素梅教授的经验用方。王教授认为抽动障碍的主要病机为脾虚肝亢、风痰内扰,结合小儿“肝常有余、脾常不足”的生理特点及五行生克理论，认为“土衰则木横，木横则土益衰”，土虚不能制约肝木，土虚风动，出现运动性抽动的症状，肝风夹痰上扰可见发声性抽动的表现。因此采用扶土抑木之法，健脾平肝，由六君子汤合泻青丸加减化裁，创立健脾止动汤。取六君子汤健脾益气、燥湿化痰，达到实脾以抑肝木之效；用泻青丸清肝泻火，以平抑肝风；二者合用以达到扶土抑木之功。肝与先天肾为肝肾同源关系，以藏泻互用为前提，肝疏泄功能正常，肾精充足才能充髓养脑；且肝脉络于脑。而脾为气血生化之源，可升清阳上达以荣脑。前期研究发现健脾止动汤可以改善患儿抽动症状，提高患儿血清中BDNF含量[6]，同时也可改善慢性束缚应激抽动障碍大鼠的刻板行为及学习记忆能力[7]。

目前神经解剖与功能影像学研究显示，抽动障碍的发病与大脑皮质—基底节—丘脑—皮质神经环路的结构与功能发育异常相关，前额叶皮质是其重要环节[8-9]。临床研究显示抽动障碍患儿存在前额叶皮质厚度变薄[10-11]，通过前额叶局部的经颅磁治疗可用于本病的治疗[12]。尼氏小体是由神经元胞质内发达的粗面内质网和分布其间的游离核糖体构成，用于合成更新细胞器所需的结构蛋白、合成神经递质所需的酶类以及神经肽[13]。当尼氏小体正逐步减少甚至消失时，说明神经细胞在遭受损伤。尼氏染色结果显示，与空白组相比，模型组大鼠均可见前额叶皮质区尼氏小体显著减少；与模型组相比，健脾止动汤组尼氏小体表达显著增多，提示模型组大鼠存在前额叶皮质的神经元损伤，健脾止动汤具有保护大鼠前额叶皮质神经元的功能。

神经营养因子能支持和调控神经组织的生长发育，对受损区域的神经元及其附属结构起到保护和修复作用。BDNF是体内含量最多的神经营养因子，广泛参与大脑的调节功能，包括运动、学习和记忆等。生物遗传学和心理学研究发现[14]，BDNF Val66Met多态性是我国汉族人群抽动障碍的常见遗传易感性，同时临床发现[15]较低浓度的血清BDNF多提示抽动障碍患儿远期预后效果较差。BDNF与其受体肌球蛋白相关激酶B结合，引起受体磷酸化，进而激活神经元的下游细胞内信号，抑制皮质区多巴胺能神经元中谷氨酸引起的神经毒性[16]。本研究结果显示健脾止动汤组大鼠前额叶皮质BDNF较其他组升高，与课题组前期研究健脾止动汤可提高抽动障碍患儿血清中BDNF水平的结论相一致[6]。

IGF-1是一类具有类胰岛素样作用的生长因子、非选择性神经营养因子，参与情绪的控制与调节。在神经系统中大脑皮层、海马等区域可检测到高水平的IGF-1[17]，而循环系统中70～90%的IGF-1由肝脏合成和分泌，受生长激素体调节，可通过血脑屏障进入神经系统[18]。当神经元受损后脑组织需要大量的IGF-1，大量外周血中的IGF-1可通过血脑屏障进入脑组织。研究发现IGF-1有促进多巴胺能神经元细胞存活和增值的能力[17]。运动神经障碍患者的脑脊液中IGF-1水平较健康对照组明显降低[19]，而外源性IGF-1可降低抽动大鼠纹状体内氨基酸递质水平及凋亡蛋白的表达[20]。本研究结果提示模型组大鼠存在IGF-1分泌不足，而健脾止动汤可促进模型鼠前额叶皮质IGF-1的表达。

NGF是最早发现的细胞生长调节因子，是交感神经元和感觉神经元的生长和存活所必须的。血脑屏障对NGF具有选择性通透作用，发生脑损伤时，NGF更容易透过血脑屏障，进入脑组织中[21]。葛莉等[22]通过临床分析130例抽动障碍患儿的血清NGF水平，发现患儿血清中NGF水平升高，且与病情严重程度密切相关。而NGF及其受体在应激相关的情绪障碍的发病机制中起着关键作用[23]，慢性应激暴露可导致大鼠前额叶皮质NGF水平显著下降[24]。本研究结果显示模型组前额叶皮质NGF水平与空白组无明显差异，与相关报道不一致。推测原因可能与慢性束缚应激的暴露降低了抽动障碍大鼠前额叶皮质NGF含量；也可能与慢性束缚应激抽动障碍大鼠存在5-羟色胺水平升高有关[5]，因5-羟色胺可上调NGF的水平[25]。

本研究的局限性在于仅采用Elisa法对大鼠前额叶皮质中相关神经营养因子的含量进行测定，方法较为单一，且未对相关神经营养因子的不同活化形式及受体进行测定，样本量较小。后期需增加样本量，采用不同检测方法，更加深入地研究其具体作用机制。

本研究初步验证了健脾止动汤可提高大脑皮质神经营养因子的表达，从而降低模型组大鼠神经元的损伤，揭示了健脾止动汤可能是通过调节神经营养因子在前额叶的表达，减轻神经元损伤，起到神经保护作用，从而发挥抗抽动效应。