山苍子精油生物活性及其包埋技术的研究进展

刘 尧， 刘健华， 夏 琛， 崔心禹， 沈建福

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院1，杭州 310058)(浙江晟泰茶油科技有限公司2，衢州 324200)

山苍子[Litseacubeba(Lour.)Pers.]，又名山鸡椒、山胡椒、木姜子、荜澄茄等，为樟科，樟属落叶小乔木，高3～10 m。其树皮为灰白色，幼枝黄绿色，被柔毛，老枝为黑褐色，无毛。顶芽呈圆锥形，鳞片无毛。叶互生，伞状花序生于叶腋短枝上，先叶开放。山苍子的花期在3～5月，7～9月结果实。其果实近球形，成熟时为蓝黑色[1]。因其生长适应能力强，广泛分布于世界各地，在我国主产于长江以南区域的向阳丘陵、山地灌木丛或疏林中[2]。山苍子的叶、花、根及果皮均含有精油，以新鲜果实的含油率最高，经水蒸气蒸馏，精油得率为2%～6%[3-5]。一般商品山苍子精油多指由山苍子果实提取的精油[6]。山苍子精油外观呈浅黄色油状液体，具有怡人的柠檬样香气，其化学成分主要为萜烯及萜类化合物，包括单萜类化合物、倍半萜类化合物及少量的其他化合物等[7]。其中，以单萜类化合物柠檬醛的含量为最高，占总含量的70%～80%[8]。

目前已有许多文献表明，山苍子精油对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌等细菌[9，10]及辣椒疫霉、黄曲霉、青霉等真菌[11-13]的生长有抑制作用，还具有抗氧化、抗炎、驱蚊、除螨等生物活性[14-16]。但山苍子精油为挥发性油，其沸点低，性质不稳定，易在空气中扩散，若直接运用，随着时间的延长，其抑菌效果得不到保证；且其中的疏水基团可与蛋白质和脂质相结合，形成不均匀分布，使精油抗菌能力降低[17]。此外，山苍子精油水溶性差，限制了其在水相体系中的发展应用。目前已有许多研究致力于包埋山苍子精油，以期达到更好的应用效果。本文综述了山苍子精油的生物活性及近年来山苍子精油的包埋技术，为后续的深入研究提供依据。

1 山苍子精油生物活性

1.1 山苍子精油的抑菌活性

良好的抑菌活性是山苍子精油突出的特点，其可有效抑制一系列细菌和真菌的生长。Hu等[9]发现山苍子精油不仅对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的细胞膜具有破坏作用，导致细菌细胞内生物大分子泄漏，还可以抑制MRSA的呼吸代谢，并降低戊糖磷酸途径(HMP途径)中关键酶的活性。此外，山苍子精油的主要成分柠檬醛可能进一步与MRSA的DNA形成嵌合体，从而抑制MRSA的生物学活性。彭湘莲等[18]采用平板菌落计数法检测山苍子精油的抑菌活性。结果表明，山苍子精油对大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、白曲霉(AspergilluscandibaisLink)、青霉(Penicillium)4种菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)分别为1.88、0.94、0.94、0.47 μL/mL。Yang等[19]的实验证明，山苍子精油对革兰氏阴性的食源性细菌如沙门氏菌(Salmonella)、E.coliO157、E.coliDH5α、E.coliO104具有明显的抑菌作用，MIC分别为0.05、0.1、0.5和0.5 μL/mL，且所有细菌的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)均低至1.0 μL/mL。表明山苍子精油可作为食品防腐剂，避免食品受到革兰氏阴性细菌的污染。

1.2 山苍子精油的抗氧化活性

山苍子精油能够清除自由基，具有优良的抗氧化活性。Wang等[20]从不同角度评价了山苍子精油的抗氧化活性和清除自由基的能力，并与柠檬醛及抗坏血酸(VC)、合成抗氧化剂丁羟甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)进行比较。结果表明，山苍子精油具有突出的抗氧化活性，清除羟自由基的半抑制浓度IC50值为0.19 mg/mL，且羟自由基清除活性的大小顺序为：山苍子精油>BHT>柠檬醛>PG>VC。山苍子精油对超氧化物自由基也具有一定清除能力，IC50值为0.45 mg/mL。此外，山苍子精油的加入能够明显抑制亚油酸的过氧化反应。Roktim等[14]评价了山苍子果实精油和山苍子叶精油清除DPPH自由基的活性，并与VC作对比。结果显示，DPPH自由基清除活性的大小顺序为：山苍子果实精油>VC>山苍子叶精油，三者对DPPH自由基的IC50值分别为0.980 3、1.483、2.819 μg/mL。李欣欣等[21]从山苍子雌花和雄花中提取精油，检测其还原力、DPPH自由基和羟自由基的清除能力。经测定，雄花精油和雌花精油的还原力IC50值分别为2.330和1.473 mg/mL；清除DPPH自由基IC50值分别为41.62和9.663 mg/mL；清除羟自由基IC50值分别为56.95和77.98 mg/mL，表明山苍子雌花和雄花精油均具有一定的抗氧化活性。

1.3 山苍子精油对蚊虫的驱避活性

杨中林[22]采用“Y”型嗅觉仪，测定了22种植物精油对白纹伊蚊的驱避活性，结果表明，在精油用量为0.5 μL，作用时间为20 min时，山苍子精油对白纹伊蚊的驱避率达到100%，效果最好；且山苍子精油与薄荷油复配精油的驱蚊效果好于单一精油。陈飞飞等[23]发现涂抹剂量为1.5 mg/cm2时，山苍子精油可在3.70 h内100%驱避白纹伊蚊，且其对白纹伊蚊幼虫和蛹表现出很强的毒杀活性，对白纹伊蚊4龄期幼虫24 h的致死中浓度LC50值为82.48 μg/mL。

赤拟谷盗是一种仓储粮食害虫，广泛存在于世界各地，且其中有很大一部分已对传统熏蒸方法产生抗性。宁蕾[24]使用山苍子精油熏蒸粮食以减少虫害，发现山苍子精油对赤拟谷盗的驱避率在24 h内可达到100%。斜纹夜蛾(Spodopteralitura，SL)是分布于东南亚地区的害虫之一，可对大豆、棉花和蔬菜等作物产生极大的危害。李湘洲等[25]发现山苍子精油具有抑制SL细胞增殖的作用，当山苍子精油质量浓度为0.015%时，SL细胞的存活率极显著降低(P<0.01)。

2 山苍子精油包埋技术

2.1 微胶囊

微胶囊技术是一种用成膜材料包覆气体、固体或液体材料，形成微小粒子的技术[26]。微胶囊技术可以对植物精油进行包埋，其能够在壁材和芯材间架起一个物理屏障[27]，使精油免受外界不良因素的影响，提高了精油的储藏稳定性。同时微胶囊技术将液态的精油转变成固体粉末，便于运输及使用[28]；在适当的条件下，还可控制微胶囊中精油的释放，使精油发挥持久有效的作用[29，30]。目前，精油微胶囊常用的壁材有碳水化合物、植物胶、蛋白质、脂类、纤维素及其衍生物等[31-34]，它们可以单独使用，也可将2种或2种以上的壁材结合使用。

杨艳红等[35]以β-环糊精(β-CD)包埋山苍子精油，探究研磨法、饱和水溶液法、冷冻干燥法、喷雾干燥法4种微胶囊制备技术对山苍子精油的包合及释放效果。其中，以喷雾干燥法的包埋率最高，达79.15%，其后依次为冷冻干燥法、饱和水溶液法和研磨法。从释放率来看，研磨法制备的微胶囊并未明显减缓精油的释放速率，而在其他3种方法中，喷雾干燥法对精油的保护效果最佳，表明喷雾干燥法制备的微胶囊能有效保护山苍子精油，提高精油稳定性，减缓其释放速率。付红军等[36]分别采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、黄原胶(XG)、阿拉伯胶(AG)、明胶、可溶性淀粉(SS)、HP-β-CD/AG和β-CD/AG作为壁材，通过喷雾干燥法制备山苍子精油微胶囊。结果显示，HP-β-CD/AG、HP-β-CD、AG和SS与山苍子精油制备的乳液稳定，不分层，其中以HP-β-CD/AG为壁材制备的山苍子精油微胶囊包埋率为83.80%，表面形貌优于其他微胶囊，呈大小均匀、流动性好的圆球形。这进一步说明喷雾干燥法是制备山苍子精油微胶囊较为理想的方法，且以HP-β-CD/AG作为壁材能提高乳液稳定性，使制备的微胶囊呈现较好的表面形貌。

Wang等[37]采用饱和水溶液法制备了壁材为β-CD的山苍子精油微胶囊，包封率为33.60%，载药率为9.07%。微胶囊粒径为17.852 μm，热稳定性良好，颗粒尺寸趋于均匀。抗真菌活性测试显示，微胶囊能够抑制从采后柑桔中分离的桔青霉菌(P.italicum)、指状青霉(P.digitatum)和白地霉(G.candidum)的生长，表明此微胶囊有望替代化学杀菌剂，以保护柑橘类水果免受采后的真菌病害。唐海兵等[38]通过β-CD包埋山苍子精油，制备负载微胶囊的活性保鲜垫，并应用于草鱼肉片的冷藏保鲜。结果表明，分散有山苍子精油微胶囊的保鲜垫对草鱼肉片有着较为理想的保鲜效果，有效抑制了肉片中腐败微生物的生长，减缓了脂质氧化，在一定程度上维持了草鱼的品质，将草鱼货架期延长了2～3 d。高玉敏等[39]以山苍子精油为芯材，海藻酸钠、壳聚糖为壁材，制备山苍子精油缓释微胶囊保鲜剂。将大米置于30 ℃，相对湿度≥90%的环境下储藏60 d后发现，添加保鲜剂组的总酸值显著低于未添加组(P<0.05)，且未添加组和添加组的霉菌总数分别为7.1×105和1.3×103cfu/g。山苍子精油缓释微胶囊保鲜剂对大米具有明显的保鲜防霉作用。

2.2 纳米乳

纳米乳是由不同比例的油、水、表面活性剂和助表面活性剂组成的胶体分散体系，具有较高的动力学稳定性、低黏度和透光性，并可用天然成分配制[40-43]，液滴大小通常在20～200 nm之间[44]。纳米乳液根据乳液与水相和油相之间的界面张力可以将其分为水包油型(O/W)乳液和油包水型(W/O)乳液，O/W型乳液可以提高难溶于水的物质的溶解度，而W/O型乳液可以减缓水溶性物质的释放速率[45，46]。

使用纳米乳包埋精油，可以很容易地使精油分散在食品中微生物生长和扩散的区域[47]，还能提高精油的稳定性并保持其生物活性，降低其对食品感官特性的影响[42，43]。Wang等[48]使用超声均质化技术制备纳米乳，其平均液滴尺寸为(101.1±1.2) nm，且在4 ℃和25 ℃下均具有良好的稳定性。此外，山苍子精油纳米乳对食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)和腐败菌波罗的海希瓦氏菌(S.baltica)均表现出较好的抑制作用，36 h后，2种细菌的存活数明显少于纯精油处理组，表明纳米乳比纯精油具有更强的抗菌作用。山苍子精油纳米乳还能够抑制2种细菌生物膜的形成，这可能与其优越的抗氧化能力有关。陈韵如[49]制备的山苍子精油纳米乳平均液滴尺寸为(49.23±1.23) nm，多分散系数(PDI)为(0.153±0.003)，乳液内粒子分散性较好，且放置90 d后仍然处于稳定状态。此纳米乳还对多重耐药大肠杆菌(Multidrug-resistantEscherichiacoli，MREC)具有抑菌作用，MIC和MBC分别为4.2和8.2 μL/mL，其抑菌机理可能是通过破坏细菌的细胞膜，导致胞内大分子物质和酶外泄，同时调节膜受体基因、编码物质代谢通路和能量代谢通路上的多种酶和蛋白的基因，使细菌无法正常生长繁殖。通过建立E.coli动物感染模型，发现山苍子精油纳米乳液能在一定程度上提高机体白细胞、血小板、淋巴细胞等免疫细胞的数目，增强机体抵抗力，对E.coli所致疾病有一定的预防作用。

冯文旭[50]采用高速搅拌结合高压均质的方法制备山苍子精油初级乳液，其平均粒径为203.9 nm，且在21 d内表现出较好的储存稳定性。该纳米乳对禾谷镰刀菌菌丝体具有一定损伤作用，并在0.3 mg/g质量浓度下对禾谷镰刀菌产生的呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)及其衍生物15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyl-Deoxynivalenol，15ADON)的抑制率分别达到66.1%和99.4%。将壳聚糖结合在山苍子精油乳液表面，制备得到平均粒径为454.9 nm、Zeta电位为64.2 mV 的二级乳液，将其应用于制麦过程，可有效提升大麦发芽力。王彦波等[51]制备了山苍子精油O/W型纳米乳，其具有较强的低温稳定性和良好的抗菌、抗氧化活性，能够抑制三文鱼的腐败，延长三文鱼的货架期，表明此种纳米乳有望作为一种新型的水产品保鲜防腐剂。

2.3 可食用复合膜

可食用复合膜以可食性大分子物质为主要成膜材料，加入食品添加剂，经过混匀、加热、加压、涂布等工艺，使膜液分子发生相互作用，膜液中水分子蒸发而形成具有一定工程特性和选择透过性薄膜。预先制备的独立膜称为薄膜，通过浸渍、喷洒在食品表面形成的薄膜称为涂层[52]。可食用复合膜具有适当阻隔性，可替代或强化食品表面的天然层，延缓食品中水分、香气成分等的迁移和扩散，同时具有选择透气性，允许氧气，二氧化碳和乙烯等重要气体的交换[53]；可食用复合膜还具有较好的机械性能，保护食品免受机械损害，便于加工处理并延长食品感官品质的保持时间；且其能够作为抗氧化剂或抑菌剂等食品添加剂的载体，起到缓释作用[54，55]。此外，可食用复合膜相比不可降解的包装材料更加环保，有助于减少环境污染[56]。

以天然植物精油作为抗菌剂，制备可食用复合膜，具有良好的抗菌、抗氧化及保鲜作用[57]。Zheng等[58]将苦槠粉和壳聚糖共混，再加入山苍子精油，制得的可食用复合膜对S.aureus和E.coli表现出良好的抗菌活性，MIC分别为580、600 mg/kg。孟金明等[59]将壳聚糖和乳清蛋白作为主要成膜基质，添加6%的山苍子精油配制复合膜液，此时的复合膜能显著降低冷藏枇杷的失重率(P<0.05)，并明显提高其出汁率；枇杷冷藏贮存15 d后，复合膜处理组果实中丙二醛含量显著低于对照组(P<0.05)，表明复合膜处理能有效抑制膜脂过氧化作用，使果实细胞膜的完整性得到保护。此外，复合膜还能明显抑制木质素合成相关酶的活性，减缓木质素的合成，减少储藏过程中冷害的发生，从而延长枇杷果实的货架期。古佳慧[13]以山苍子精油、壳聚糖、玉米淀粉以及甘油为原料制成山苍子精油壳聚糖保鲜复合膜，并将其应用于红颜草莓和章姬草莓的保鲜。发现在4 ℃及室温下，其能显著地减缓草莓的腐烂率、失重率及丙二醛含量的上升(P<0.05)，草莓果实硬度、营养成分及呼吸强度下降的速率也明显变慢。且山苍子精油壳聚糖复合膜能使红颜草莓和章姬草莓的储藏期在室温下延至9 d，在4 ℃下分别延至18、15 d。这表明所制备的复合膜可有效抵抗外界微生物的污染，延长草莓的储藏期。彭湘莲等[60]制备了山苍子精油壳聚糖复合涂膜液，在室温条件下，使其在金柑果实表面形成一层薄膜，并储藏30 d。结果发现，复合涂膜抑制了金柑果实的失重，且涂膜处理组果实中可溶性固形物、可滴定酸、VC、总糖含量及感官综合指数均优于对照组，表明山苍子精油壳聚糖复合涂膜降低了金柑果实中营养物质的消耗，有效地延缓了金柑果实的衰老，对金柑有良好的保鲜作用。

2.4 纳米纤维膜

静电纺丝是一种利用高压静电场生产连续纤维的技术，可快速生产微米级至纳米级的纤维[61]。典型的静电纺丝装置由高压电源、带针头注射器的喷射装置和接收装置组成[62](如图1所示)，其原理是通过高压电源向接收装置和不锈钢针头之间施加1～30 kV的电压[63]， 具有一定分子链缠结的聚合物溶液或熔体在注射泵的推动下经针头喷出，在高压电场的作用下克服表面张力，在针头处形成 Taylor锥，带电的聚合物射流从Taylor锥中喷射出来，当溶剂挥发后，射流以螺旋的形式部分拉长，形成无纺状态的纳米纤维，沉积在接收装置上[64]。

图1 静电纺丝装置示意图

静电纺丝技术制备的纤维具有许多优点，如纤维连续性好、高比表面积和高孔隙率等；此外，静电纺丝纤维还可以实现对活性物质的包埋及控释，且由于其加工条件温和，能够有效保护活性成分的稳定性及生物活性[65，66]。山苍子精油是效果良好的天然抗菌剂，将山苍子精油加入到聚合物溶液中，通过静电纺丝，可制备具有抗菌特性的纳米纤维。Cui等[67]首先通过溶液-超声法将山苍子精油包封在β-CD的空腔中，形成包合物，以减少山苍子精油在加工过程中的挥发。当包合物的质量浓度为7.5mg/mL时，制备的山苍子精油/蒲公英多糖(LCO/DP)纳米纤维的平均直径为241 nm，厚度为(0.05±0.008)mm，抗拉强度和断裂伸长率都达到最大值，且热重分析表明其具有良好的热稳定性。琼脂扩散实验中，LCO/DP纳米纤维对S.aureus的抑菌圈直径达到(19.8±0.5)mm；在25 ℃下，采用平板菌落计数法评价LCO/DP纳米纤维膜对S.aureus的杀菌效果，结果显示，对照组中S.aureus的数量几乎没有变化，而LCO/DP纳米纤维处理72 h后，细菌数量减少到2.75 Log cfu/mL，表明LCO/DP纳米纤维膜对S.aureus具有良好的抗菌作用。此外，纳米纤维中山苍子精油的累积释放速率在4 ℃下为44.3%，在25 ℃下为70.5%，表明此纳米纤维可使山苍子精油持续释放并发挥持久的抗菌作用，有望在食品包装、医药输送等领域得到广泛应用。

3 总结与展望

山苍子精油是一种具有极高价值的芳香精油，具有多种有益的生物活性以及优良的抗菌能力，安全性高，应用面广，但其易于挥发、水溶性差、见光易分解等特性使得其应用受到限制。包埋技术不同程度地增加了山苍子精油的溶解度和稳定性，并能控制其释放，增强其抗菌性能，为拓宽山苍子精油的应用范围提供了前提。但目前的包埋方法仍需改进，今后可从以下几个方面进行深入探究：1)在包埋过程中，尽可能使用温和的加工条件，减少其挥发的同时，提高包埋率；2)研发新型包埋壁材，减小粒子尺寸，提升水溶性，使山苍子精油适用于水相体系，并推广至其他性质相似的植物精油；3)控制山苍子精油的缓释速率，制备具有不同缓释速率的包合物，以满足更多样的需求。