黄瓜秸秆协同降解菌群的筛选及其促生效果探究

李欣 张旭 剌世凯 谢鹰飞 陈世君 高丽红 田永强

（中国农业大学园艺学院，设施蔬菜生长发育北京市重点实验室，北京 100193）

秸秆是农业生产中主要的废弃物，也是重要的可再生资源。2020年我国的秸秆产生量为7.71亿t，其中包括作物秸秆和蔬菜秸秆。与作物秸秆相比，蔬菜秸秆的营养成分丰富，含水量高，不易燃烧，且容易引发病虫害（陈慈 等，2021）。虽然我国每年产生的蔬菜秸秆量巨大，但绝大部分被直接丢弃或者露天焚烧，不仅造成资源浪费，而且严重污染环境（吴文辉 等，2020）。

将蔬菜秸秆原位还田，能够有效避免因秸秆离田后处置不当造成的资源浪费和环境污染（陈慈 等，2021；吴文辉 等，2021）。有研究发现，蔬菜秸秆还田后，其腐熟产生的养分可以增加土壤有机质含量，改善土壤质量，并提高作物产量（吴文辉 等，2021）。然而，一些蔬菜（特别是果菜类）秸秆的主要成分是由纤维素、半纤维素和木质素构成的复杂木质纤维素结构，田间降解难度大（Zhang et al.，2021），这不仅导致了秸秆原位还田后难以被充分利用，而且阻碍了蔬菜秸秆还田腐熟的推广和普及。

微生物通过产生纤维素酶将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖，在秸秆降解过程中发挥了重要作用（Covino et al.，2020）。在自然条件下，秸秆降解是多种微生物协同作用的结果（Qu et al.，2020；Zhang et al.，2021）。近些年，越来越多的研究发 现，纯培养分离的单菌株的纤维素降解能力较弱，而将多种纤维素类降解菌混合培养后，纤维素酶的多样性增加，多种酶协同作用共同提高了秸秆的降解率（Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019）。因此，利用微生物间的协同关系，人工筛选构建一个高效的协同降解菌群是提高秸秆降解效率的重要方式。尽管如此，目前鲜见与蔬菜（特别是果菜类）秸秆协同降解菌群筛选相关的研究报道，实际生产中仍缺乏蔬菜秸秆的专性降解菌剂。值得注意的是，在生产中，除评价筛选的协同降解菌群对秸秆的降解效果外，还应关注菌群是否会对作物生长产生不利影响。

为解决蔬菜秸秆协同降解菌群缺乏及其对作物生长影响不明确的问题，本试验以黄瓜秸秆为试验材料，以菜田土壤、优质堆肥、蚯蚓粪和生物炭的混合物作为混合物料，采用专化缺碳培养基筛选了能够专性降解黄瓜秸秆的高效协同降解菌群，测定了其在黄瓜秸秆降解过程中的相关指标，分析了该协同降解菌群的群落组成和碳源利用特征，并通过种子测试和幼苗测试探究了协同降解菌群对黄瓜生长的影响。此外，分离纯化了协同降解菌群的单菌株，并鉴定了其纤维素降解能力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为中农26 号（中国农业科学院蔬菜花卉研究所育成品种）。

磷酸盐 缓冲液：KHPO0.661 8 g，KHPO0.163 3 g，MgSO0.1 g，NaCl 6.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；液体专化缺碳培养基：MgSO·7HO 0.4 g，KHPO1.323 8 g，KHPO0.326 6 g，CaCl·2HO 0.05 g，FeSO·7HO 0.01 g，MnSO·HO 2.1 mg，ZnSO·7HO 0.25 mg，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2；菌源：在100 mL磷酸盐缓冲液中加入10 g 固体混合物料（由菜田土壤、优质堆肥、蚯蚓粪和生物炭混合而成），于28 ℃和200 r·min转速条件下振荡培养1 h 获得。

1.2 试验设计

试验于2018 年6月至2021 年9月在中国农业大学园艺学院设施蔬菜栽培生理与环境调控实验室进行。

1.2.1 黄瓜秸秆协同降解菌群的筛选 将5 g 黄瓜秸秆剪成3～4 cm 长的小段，装入125 mL 含有4%（体积比）菌源的液体专化缺碳培养基中，共设置4 次重复，于30 ℃和200 r·min转速条件下限制性培养15 d。将培养15 d 的混浊菌液作为菌源，取出5 mL 接种到新的液体专化缺碳培养基中，其余的原料和步骤均不变，继续振荡培养15 d。如此连续限制性继代培养10 代以上（＞ 150 d），得到的菌液即为能够稳定降解黄瓜秸秆的专性高效协同降解菌群。

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1.2.2 黄瓜秸秆降解特性与协同降解菌群特征测定 吸取5 mL 继代培养10 代后的协同降解菌群菌液，加入到含有5 g 秸秆的125 mL 液体专化缺碳培养基中继续继代培养，将继代培养0、1、3、6、9、12、15 d 的秸秆用自来水冲洗3～4 次，直至将多余的微生物杂质冲洗干净，在65 ℃烘箱烘干至恒重，用百分之一天平测定降解前和降解后的秸秆干质量，计算秸秆降解率。

式中和W分别为降解前和降解后的秸秆干质量。

木质纤维素组分采用Goering 和van Soest（1971）的方法测定并计算其降解率：将继代培养0、1、3、6、9、12、15 d 后烘干的黄瓜秸秆，用打样机粉碎后过1 mm 筛孔，称取0.5 g 放入F57专用袋中，用ANKOM220 纤维分析仪（USA）分析纤维素、半纤维素和木质素的含量。

取继代培养0、1、3、6、9、12、15 d 的秸秆-菌群混合培养液测定其pH、菌液浓度OD和纤维素酶活性。pH 采用电位计法测定。菌液浓度用OD表征，采用紫外可见分光光度计测定。纤维素酶活性（底物为纤维素）采用Ghose（1987）的方法测定。

1.2.3 黄瓜秸秆协同降解菌群的群落组成和碳源利用特征 利用PowerSoil DNA 试剂盒（MoBio Laboratories Inc.，CA，USA）提取协同降解菌群的总DNA，采用NanoDrop ND-2000（Thermo Fisher Scientific，USA）测定其浓度和质量。以提取的DNA 为模板，PCR 扩增后进行高通量测序（Li et al.，2021）。细菌引物为515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′），真菌引物为ITS1F（5′-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3′）。采用Biolog ECOPLATE（包含31 种单一碳源和1 个水空白）测定微生物碳源利用水平（Fan et al.，2016）。

1.2.4 协同降解菌群中单菌株的分离和鉴定 采用无菌水梯度稀释协同降解菌群，制成10～10浓度的菌悬液，涂布在添加了制霉素的R2A（Bai et al.，2015）固体培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～4 d。挑取合适的单菌落进行划线分离，通过4～5 代的划线纯化得到单菌株。挑取分离纯化的单菌株制备菌悬液进行菌落PCR，选用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对细菌的16S rDNA 基因序列进行PCR 扩增，将测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，根据同源性在GenBank 中寻找相似性最大菌株的基因序列。使用MEGA 5 软件采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育进化树，并用Bootstrap 对进化树进行1 000 次可信度分析。利用高通量测序获得菌群的群落组成。

1.2.5 纯化单菌株的纤维素降解能力测定 挑取分离纯化的单菌株于灭菌的R2A 液体培养基中，在28 ℃和200 r·min转速条件下培养24 h 制备菌悬液，吸取5 μL 菌悬液点斑在刚果红-纤维素培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，观察菌落周围是否有透明水解圈，并用直尺测量水解圈直径（D）和菌落直径（d），每个单菌株设置3 次重复，每个重复1 个皿。

1.2.6 种子测试 将协同降解菌群接种至液体专化缺碳培养基中，在30 ℃和200 r·min转速条件下培养，直至菌悬液在600 nm 处的吸光值（OD）大于1.0，用无菌水将菌悬液稀释成OD值分别为0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 的不同浓度（分别简称为OD 0.2、OD 0.4、OD 0.6、OD 0.8 和OD 1.0）。将表面消毒的黄瓜种子（75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3 次，3%次氯酸钠浸泡8 min，无菌水冲洗6 次）置于不同OD值的菌悬液中浸泡8 h，以无菌水为对照（CK），将浸泡后的种子置于铺有双层无菌滤纸的培养皿中，每皿6 粒，分别加入7 mL无菌水，在28 ℃和70%～80%相对湿度条件下培养。试验共6 个处理，每个处理5 次重复，每个重复1 个皿。

培养3 d 后统计黄瓜种子的发芽率，用万分之一天平测定鲜质量。采用EPSON EXPERSSION 4900 型扫描仪扫描黄瓜种子苗根系，然后用Win RHIZO 软件进行分析，获得总根长、根体积、根表面积。采用Image J 测定胚轴长和茎长。统计种子活力指数。

采用EPSON EXPERSSION 4900 型扫描仪扫描黄瓜幼苗根系和叶片，然后用Win RHIZO 软件进行分析，获得总根长、根体积、根表面积、根尖数和最大真叶的叶面积。采用直尺测量株高，采用数码游标卡尺测量茎粗，采用直接计数法统计叶片数，采用SAPD 仪测定最大真叶的叶绿素含量。

将黄瓜幼苗的地上部和地下部自茎底端分开后，分别用万分之一天平测定鲜质量，然后在105 ℃的烘箱中杀青30 min 后，85 ℃烘干直至恒重，再测定干质量。

式中TDW、SDW 和RDW 分别表示全株干质量、地上部干质量和地下部干质量，PH 和SD 分别表示株高和茎粗（Sun et al.，2020）。

1.3 数据统计与分析

采用EXCEL 2016 和SPSS 23.0 软件对试验数据进行统计分析及方差分析，采用Tukey’HSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 黄瓜秸秆的降解特性与协同降解菌群的特征

黄瓜秸秆的降解率、木质纤维素含量及秸秆-菌群混合培养液的OD、pH、纤维素酶活性的变化如图1 所示。在15 d 的培养过程中，秸秆干质量在培养0～6 d 迅速下降，6 d 时秸秆降解率达到73.3%；此后，秸秆干质量的下降速率变慢，培养15 d 时秸秆降解率为80.7%。木质纤维素组分（特别是纤维素）含量随培养时间的变化趋势与黄瓜秸秆干质量基本一致。培养15 d 时，协同降解菌群对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别是78.8%、74.7%和49.4%。表明协同降解菌群能够通过降解木质纤维素组分有效降解黄瓜秸秆。

图1 黄瓜秸秆降解特性与协同降解菌群特征随时间的变化

在降解黄瓜秸秆的过程中，协同降解菌群与秸秆的混合培养液pH 在0～12 d 持续上升，且0～1 d 的上升速率最快，培养12 d 时达最高（8.79），随后开始下降。培养液pH 的上升可能是由于在协同降解菌群降解黄瓜秸秆的过程中产生了碱性物质所致。OD反映了培养液中微生物的密度。在协同降解菌群降解黄瓜秸秆过程中，其OD在培养1 d 后便急剧增加，此后平稳上升并于培养6 d 后达到最大值（2.192），随后开始缓慢下降。这说明，当以黄瓜秸秆为唯一碳源时，协同降解菌群在短期内（＜ 1 d）就能迅速大量繁殖并降解大部分黄瓜秸秆。与OD的变化特征相似，纤维素酶活性在培养0～9 d 呈现上升趋势（其中0～6 d 上升迅速），培养9 d 后达到酶活性高峰（0.110 4 IU），此后呈缓慢下降趋势。

综上所述，黄瓜秸秆协同降解菌群的生长繁殖情况与秸秆干质量、木质纤维素组分含量、培养液pH 和纤维素酶活性的变化具有一致性和关联性：培养0～6 d 协同菌群繁殖迅速，pH 和纤维素酶活性迅速上升，而秸秆干质量及纤维素、半纤维素、木质素的含量迅速减少，使得秸秆降解率迅速上升；后期协同降解菌群生长缓慢，各个指标的变化趋势也相应变缓。

微生物碳源利用水平可以反映秸秆降解过程中微生物对不同碳源的利用程度。由表1 可知，协同降解菌群可以利用31 种碳源中的23 种，只有8种（L-Arginine、i-Erythritol、2-Hydroxy Benzoic Acid、4-Hydroxy Benzoic Acid、α-Cyclodextrin、Glycogen、Itaconic Acid 和α-Keto Butyric Acid）不能被利用。从六大类碳源物质水平上看，黄瓜秸秆协同降解菌群可以利用碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、酰胺/胺类和聚合物类的绝大部分。总体来看，黄瓜秸秆协同降解菌群的碳源利用多样性较高但具有一定的特异性，因本试验是以黄瓜秸秆为唯一碳源进行筛选，由此推测黄瓜秸秆中只含有碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、酰胺/胺类和聚合物类五大类碳源物质。

表1 协同降解菌群的碳源利用特征

2.2 黄瓜秸秆协同降解菌群的群落组成和单菌株特性

在门水平下，协同降解菌群的优势群落（相对丰富度＞ 1%）为拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、异常球菌门（Deinococcota）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）和蛭弧菌门（Bdellovibrionota）等8个门。优势群落的占比达到97.88%，其中拟杆菌门占比最高，达64.36%（图2-A）。在属水平下，协同降解菌群的优势群落（相对丰富度＞ 1%）为、、、、、、、、、、和等12 个属，在整个群落中占比达到97.88%（图2-B）。

图2 协同降解菌群的群落组成和分离单菌株的系统发育树

从协同降解菌群中分离出33 个单菌株，基于16S rDNA 测序和BLAST 同源性比对构建了系统发育树（图2-C）。绝大多数的菌株与相似性最高的菌株同源性≥ 97%，但是菌株2-7 和4-24 与相似性最高的菌株同源性分别只有94%和95%（属于新种属）。绝大多数菌株分别属于、、、、、、，、、、、、、、、、、、、、、和。

在刚果红-纤维素培养基上产生水解圈表明单菌株具有降解纤维素的能力，水解圈直径与菌落直径比值（D/d）的大小可表示菌株降解纤维素能力的强弱。本试验共筛选出33 个单菌株，其中有15个单菌株产生水解圈，具有降解纤维素的能力（表2）。其中编号1-3 和5-33 的2 个菌株降解能力明显高于其他菌株。由此可知，在黄瓜秸秆协同降解菌群中，并非所有的菌株都具有降解纤维素的能力，其他的菌株可能发挥协同降解的间接作用或者参与下一步的物质分解。

表2 协同降解菌群中单菌株的纤维素降解能力

2.3 黄瓜秸秆协同降解菌群对黄瓜生长的影响

种子苗鲜质量、根长和活力指数是反映种子苗生长状况的重要指标。不同OD的协同降解菌群对黄瓜种子苗鲜质量和根系相关指标的影响如图3 所示。当OD为0.4 和0.6 时，协同降解菌群会显著增加黄瓜种子苗的鲜质量，较CK 分别提高13.4%和16.0%。协同降解菌群对黄瓜种子苗的胚轴长无影响，但在OD为0.6 和1.0 时显著提高了总根长，较CK 分别提高14.6%和21.2%。在所有OD处理下，协同降解菌群对黄瓜种子苗根体积和根表面积无显著影响。虽然协同降解菌群在OD为0.6 和1.0 时显著提高了种子的活力指数，但OD达到0.4 后所有OD处理间均无显著差异。综上所述，当协同降解菌群的OD达到0.4时，能够增加种子苗鲜质量、总根长和活力指数，对黄瓜种子苗具有很好的促生作用。

图3 协同降解菌群对黄瓜种子苗生长的影响

株高、茎粗、叶片数、最大叶面积和叶绿素含量是反映幼苗地上部生长发育的重要指标。不同OD的协同降解菌群对黄瓜幼苗生长的影响如图4。除OD 0.2 外，其他OD处理下的株高和茎粗均显著高于CK，且各处理间的株高和茎粗无显著差异。黄瓜幼苗的叶片数、最大叶面积、地上部鲜质量和地上部干质量在OD处理间表现出了与株高和茎粗相似的趋势。表明当OD达到0.4 时，协同降解菌群就能够对黄瓜幼苗地上部生长起到明显的促进作用。但是，所有OD处理的黄瓜幼苗叶片叶绿素含量均显著低于CK，这可能是因为协同降解菌群处理下叶片生长快，其叶面积扩张使得叶绿素含量相对较低。由于OD达到0.4 后，所有OD处理下协同降解菌群显著增加了幼苗地上部的鲜质量和干质量，说明虽然OD处理的幼苗叶片叶绿素含量低，但并未对植物光合产生不利影响。总根长、根体积、根表面积和根尖数是反映黄瓜幼苗地下部生长情况的重要指标。除了OD 0.2和OD 0.8，其他浓度的菌液均显著促进了总根长的增加，其中OD 0.4 的总根长增加最多，比CK 增加了57.3%。所有OD处理下的协同降解菌群均显著增加了根体积，且OD达到0.4 后显著增加了根表面积。值得注意的是，与CK 相比，仅OD 0.4处理显著增加了幼苗根尖数，增幅为79.0%；地下部鲜质量最大值也出现在OD 0.4 处理中。鲜质量和干质量是幼苗叶片光合和根系吸收水分与营养物质综合作用的结果，壮苗指数反映了幼苗的整体质量，是对幼苗质量进行综合评判的关键指标。整体来看，当OD达到0.4 后，所有OD处理间的幼苗鲜质量、干质量和壮苗指数均显著高于CK，且各OD处理间的干质量和壮苗指数无显著差异。综合考虑，当OD达到0.4 时，协同降解菌群能够对黄瓜幼苗地下部生长和整体质量起到明显的促进作用。

图4 协同降解菌群对黄瓜幼苗生长的影响

3 讨论与结论

大量研究表明，多菌株混合培养对秸秆的降解效果显著优于单菌株，不同菌株会分泌不同的纤维素酶系，多个酶系协同作用共同加快秸秆的降解（郭夏丽 等，2010；Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019）。本试验筛选的协同降解菌群能够高效降解黄瓜秸秆（图1），且对纤维素、半纤维素和木质素的降解率高于前人（Zheng et al.，2020；Chu et al.，2021）的研究结果。这主要是因为本试验以黄瓜秸秆为唯一碳源，采用专化缺碳培养基经过持续继代直接筛选协同降解菌群，而不是用单菌株人工构建复合菌群，有利于保持不同菌株的自然协同关系，避免菌株间产生拮抗作用。虽然前人报道了较多的人工组装复合菌系（Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019；Zheng et al.，2020；Chu et al.，2021），但相关研究基本都是针对大田作物秸秆，而鲜见关于蔬菜秸秆协同降解菌群的研究报道。

瓜类作物秸秆的组成结构与粮食作物秸秆（如水稻秸秆、玉米秸秆等）明显不同，其养分含量较高，且组成比粮食作物秸秆更复杂。降解纤维素类物质的酶类是一组酶，其相互配合、协同作用，最后表现为秸秆降解率的提升。本试验筛选获得的黄瓜秸秆协同降解菌群在门、属水平下种类丰富，优势群落既包括拟杆菌、变形菌、放线菌和厚壁菌等常见菌属，也包括异常球菌、疣微菌、髌骨细菌和蛭弧菌等稀有菌属（图2-A、2-B）。由于本试验的协同降解菌群对纤维素、半纤维素和木质素的降解率都相对较高（图1），因此推断自然筛选的协同菌群更有利于发挥不同菌株间的协同作用，同时有利于保持菌群的稳定性。本试验从黄瓜秸秆协同降解菌群中分离出的33 个单菌株中有近一半（15 个）的单菌株具有降解纤维素的能力，说明有些菌株虽然没有分解纤维素的能力，但是可能参与秸秆降解的后续物质变化过程或者维持协同菌群的稳定性。需要注意的是，不同菌株纤维素的降解圈只能表明对该底物的降解能力，而对自然界中复杂底物的降解率与不同纤维素降解菌所产生的分解酶的配比、活性及适宜底物、所在环境条件都有关联。

种子试验和幼苗试验均表明，当黄瓜秸秆协同降解菌群的OD达到0.4 时，就能够对黄瓜种子苗和幼苗生长及质量相关指标起到明显的改善效果（图3、4）。当协同降解菌群OD超过0.4 时，对黄瓜种子苗和幼苗的促生效果并没有进一步增加，表明此密度的降解菌群已占领了种子根系的最大表面积和有效位点，并发挥最大效能。因此，本试验筛选的协同降解菌群不仅能够高效降解黄瓜秸秆，而且对黄瓜生长有促进作用。根据前人的研究报道，能够起到促根壮秧效果的微生物种类繁多，如（Kloepper et al.，2004）、（Fu et al.，2017）、（Hu et al.，2019）和（Prathibha &Siddalingeshwara，2013）等，而这些菌也正是本试验筛选获得的能够协同降解黄瓜秸秆的菌种（图2-C）。

总体来看，本试验基于自然协同的原理筛选获得的协同降解菌群不仅能够高效降解黄瓜秸秆，而且对黄瓜生长有明显的促进效果。采用较低浓度（OD=0.4）的菌悬液，即可获得较好的促生 效果。