基于盘锦地区259例孕妇MTHFR基因多态性与不良妊娠结局相关性分析

张锦阳 孙莉丽 迟 祥 王 杨

辽油宝石花医院(盘锦，124010)

不良妊娠结局包括胚胎生长停滞、自然流产、早产、死产、胎儿畸形、出生缺陷等病理性妊娠以及分娩并发症，在我国发生率为10%～15%[1]。有研究指出，生育年龄推迟、生物学因素(如病毒、细菌、寄生虫感染等)、免疫因素以及生活压力均可能导致其发生[2]。作为叶酸代谢途径中的关键酶，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)编码基因位于染色体1p36.3上，当发生基因变异时可降低叶酸利用率，与反复流产、胎儿生长受限和死产等不良妊娠结局相关[3]。本研究对基于259例辽宁省盘锦地区妊娠期孕妇MTHFR基因多态性与不良妊娠结局相关性进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年10月-2020年10月于本院就诊的、既往有不良妊娠结局史妇女为观察组，既往无不良妊娠结局史孕妇为对照组。纳入标准：①不良妊娠组既往有明确不良妊娠史，包括胚胎停育、无脑儿、脑积水、脑瘫、唇腭裂、先天性心脏病、自然流产、神经管缺陷、肛门闭锁以及多发畸形等；②对照组 有≥1次正常妊娠史，且无不良妊娠史；③两组孕期均无服用违规药物史及放射性物质接触史；④籍贯均为辽宁盘锦，且对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①有家族遗传病史；②合并糖尿病、甲状腺功能异常等；③合并恶性肿瘤；④合并精神类疾病；⑤临床资料不全。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 MTHFR基因多态性检测

取研究对象静脉血，采用柱式DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，检测DNA浓度及纯度，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测MTHFR基因C677T和 A1298C的多态性。PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，反应体系：DNA模板1μl，上游引物和下游引物各0.5μl，10×Buffer(Mg2+)2.5μl，dNTP Mixture 2μl，rTaq DNA聚合酶1μl，ddH2O 17.5μl，反应条件和引物序列见表1。在DNA扩增结束后，将所得产物酶切后(RFLP试剂购自新西兰BioLabs公司)置37℃ 2h，行2%琼脂糖凝胶电泳，分析MTHFR基因分型。

表1 目的基因引物序列及反应条件

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0分析处理数据。计数资料以(%)表示，两组间比较采用χ2检验；采用Hardy-weinberg检验两组基因型的频率分布是否达到遗传平衡。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

观察组124例，年龄(27.9±2.7)岁(23～36岁)，收缩压/舒张压(114.3±6.2/82.8±5.7)mmHg，体质指数(BMI)(21.8±2.5)kg/m2；对照组135例，年龄(28.5±2.7)岁(22～36岁)，收缩压/舒张压(113.1±5.7/81.7±4.9)mmHg，BMI(21.6±2.4)kg/m2。两组年龄、血压及BMI无差异(P>0.05)。

2.2 Hardy-weinberg平衡检验

行Hardy-weinberg平衡检验两组标本的群体代表性和可靠性。结果表明，MTHFR C677T、A1298C两个位点2和P分别为(χ2=2.852，P=0.093；χ2=2.156，P=0.164)，基因型频率分布无差异(P>0.05)，表明收集人群样本基因型频率分布达到遗传平衡，为同一孟德尔群体结果，标本具有可比性和区域代表性。

2.3 基因型频率比较

观察组C677T位点TT频率和A1298C位点CC频率均高于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 两组基因型频率比较[例(%)]

2.4 等位基因频率比较

观察组C677T等位基因T位点频率、A1298C等位基因C位点频率均高于对照组(P<0.05)(表3)。

表3 两组等位基因频率比较[例(%)]

2.5 联合基因型频率比较

以CC/AA联合基因型频率分布作为对照，比较两组间各联合基因型频率的分布差异。结果表明，观察组携带CC/CC、CT/CC、TT/AA和TT/AC联合基因型频率均高于对照组(P<0.05)(表4)。

表4 两组C677T和A1298C联合基因型频率比较[例(%)]

3 讨论

叶酸是生理过程中必需维生素，需被叶酸还原酶激活才能发挥其生理活性。MTHFR是叶酸代谢途径中的限速酶，在催化作用下可将5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，同时还可产生大量甲基供体，使同型半胱氨酸被甲基化生成甲硫氨酸[4]。多项研究表明[1,5]，MTHFR基因变异与胚胎发育异常和流产等有关。

3.1 MTHFR基因多态性

MTHFR基因位于1号染色体短臂(1p36.22)，基因片段总长度1980bp，由12个外显子和10个内含子组成，编码656个氨基酸[6]。截至目前已经报道了数百种该基因的DNA序列变异，其中研究最多的两个单核苷酸多态性是C677T(Rs1801133)和A1298C(Rs1801131)[7]。第4外显子677T等位基因导致222位氨基酸丙氨酸被缬氨酸替代，与野生型(CC基因型)相比，MTHFR的TT纯合子和CT杂合子处理叶酸效率分别只有10%～20%和65%[8]。第7外显子1298C等位基因导致429位谷氨酸被丙氨酸替代，导致酶活性和耐热性降低。有多项研究报道了多种疾病与MTHFR基因变异相关，包括心脑血管疾病、唐氏综合征、习惯性流产、先天性出生缺陷、不育以及肿瘤等[9]。流行病学显示，677位点的变异频率因国家、地区、民族不同而具有显著差异。欧洲人群677T等位基因频率为22%～44%，非洲撒哈拉地区黑人为7%，日本人为34%，我国北方地区女性 TT型频率为37.35%，南方地区女性为10.44%[10]。有研究表明[11]，C677T和A1298C两个位点存在协同作用，杂合型MTHFR基因型组合的酶活性较野生型纯合子降低了50%，二者均可导致机体高同型半胱氨酸血症，进一步导致多种APOs的发生。

3.2 MTHFR基因多态性与APOs的相关性

本研究表明，观察组C677T位点TT频率、A1298C位点CC频率、C677T等位基因T位点频率、A1298C等位基因C位点频率均高于对照组，携带CC/CC、CT/CC、TT/AA和TT/AC 联合基因型频率均高于对照组。因此，MTHFR基因多态性与不良妊娠结局发生相关，是不良妊娠遗传易感性因素。MTHFR基因多态性导致的不良妊娠结局病理机制，笔者总结既往报道认为可能有以下原因[12-16]：①MTHFR活性下降导致DNA和蛋白质甲基化障碍，胎儿生长发育受限最终发生流产和出生缺陷，如在神经管发育期间可导致神经管闭合障碍而引起神经管缺陷；②高同型半胱氨酸血症使机体处于高氧化应激状态并增加血栓形成的风险，引起的胎盘毒性作用和血栓栓塞致使流产发生；③高同型半胱氨酸血症可通过促进血小板活化、聚集等机制损伤血管内皮细胞，从而增加妊娠期妇女发生妊高症的风险；④高同型半胱氨酸血症可诱导脂肪细胞分泌胰岛素拮抗素，引起胰岛素抵抗增加妊娠期糖尿病发生风险；⑤先天性心脏病病因复杂，目前普遍认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果，高同型半胱氨酸血症具有胚胎毒性，心血管的生长发育因此受到影响，通过与其他基因和外界因素的交互作用共同导致先心病发生；⑥胚胎神经管和颅面部的发育均起源于神经嵴细胞，叶酸缺乏是神经管缺陷的危险因素，因此MTHFR多态性也可能与非综合征性唇腭裂的发病相关。本研究未发现677和1298位点TT/CC联合基因型，根据自然选择的观点，可能是由于这种联合变异基因型存活数目较少，在胚胎或胎儿时期就因自然流产而被淘汰。

本研究还一定不足，如样本量较小且未将妊娠期妇女受教育程度、月经情况及妊娠期间服用叶酸情况等因素纳入研究，下一步可扩大样本量并进行多因素分析研究以提高研究结果的质量。

综上所述，MTHFR基因多态性与不良妊娠结局的发生有一定相关性，可对备孕人群筛查MTHFR基因多态性并早期干预，如在孕早期及时补充叶酸和维生素B12以降低血浆同型半胱氨酸水平，对降低不良妊娠发生、预防出生缺陷具有十分重要的意义。