当归芍药散对慢性盆腔炎模型大鼠免疫状态及NF-κB信号通路的影响

木则帕尔·太来提 阿尼克孜·阿不都艾尼 赛米热·艾斯拉

新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院(844000)

慢性盆腔炎(CPID)多发生在女性内生殖器及其周围结缔组织、盆腔腹膜中，也可能为沙眼衣原体感染后导致输卵管炎。已逐渐成为女性月经紊乱、腰腹疼痛甚至不孕不育的主要病因[1-2]。目前常规采用阿奇霉素、孢曲松、头孢西丁等抗生素治疗，具有良好的临床疗效，但产生的药物副作用和耐药性等问题逐渐引起重视。当归芍药散是一种中医理血方剂，主利妊娠或经期血气，调养肝脾，祛湿消肿，也可治腹中拘急，纠正胎位[3]。为探究中药治疗机理，本研究建立大鼠CPID模型，通过分析免疫状态及NF-κB信号通路变化探究当归芍药散对CPID的临床治疗机理。

1 资料与方法

1.1 动物及药品试剂

选取实验动物10周龄大鼠，大鼠体质量(200±20)g。本研究获得动物管理委员会批准同意。选取当归芍药散(农本方有限公司)，药方由当归、芍药、茯苓、泽泻、川芎、白术组成。阿奇霉素(辉瑞制药有限公司)[4]；金黄色葡萄球菌(上海颖心实验室设备有限公司)、大肠杆菌(上海颖心实验室设备有限公司)、乙型溶血性链球菌(上海颖心实验室设备有限公司)按照1∶1∶2比例溶入牛肉汁琼脂汤中配成混合菌液，菌液浓度为3×109个/ml；实验室细胞因子检测试剂盒、PCR试剂盒(美国ABCAM公司)。

1.2 实验方法

1.2.1造模取40只大鼠，随机抽取10只设置对照组，不做处理；另外30只建立CPID模型。所有大鼠均皮下注射10mg黄体酮并喂养1周，实验前1d禁食。需建立CPID模型的30只大鼠先用20%氨基甲酸乙酯行腹腔麻醉，在下腹中部做一1cm切口，暴露大鼠子宫，用注射器损伤大鼠子宫内膜。模拟创口后，在大鼠宫腔侧边注射0.2 ml混合菌液造模，完成后缝合手术切口，继续饲养3周[5]。

1.2.2给药按照给药方式不同，将30只造模大鼠分为当归芍药散组(灌胃给药1.0g/kg当归芍药散)，阿奇霉素组(灌胃给药6.0g/kg阿奇霉素)和模型组，模型组只注射相同量生理盐水。给药1次/d，连续进行2周。第14d所有大鼠禁食，第15d常规注射麻醉，取动脉血3ml，取子宫组织于-80℃保存，颈椎脱臼处死大鼠。

1.3 观察指标

1.3.1免疫状态大鼠动脉血离心取上清液，采用酶联免疫吸附实验检测血清促炎症细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抗炎症细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、IL-10水平[6]。

1.3.2NF-κB信号通路NF-κB蛋白质采用蛋白质印迹法检测，取所有大鼠子宫和卵巢组织100 mg，加入1 ml生理盐水中匀浆，以5000 r/min 离心处理10min后取上清液，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离将蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯膜上。在抗体孵育盒中加入3ml 5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，清洗膜3次后转移至4℃，以1∶1000比例与NF-κB一抗混合孵育过夜。回收一抗混合液再次洗涤膜3次，以1∶1000比例加入辣根过氧化物酶二抗混合孵育2 h[7]。孵育完成后取适量行发光液显色，再用凝胶成像系统充分曝光，采用Quantity-One软件计算NF-κB信号通路相关蛋白含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血清促炎因子水平对比

血清IL-6、IL-8、TNF-α水平，模型组、当归芍药散组、阿奇霉素组均高于对照组，但当归芍药散组与阿奇霉素组无差异但均低于模型组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清促炎因子水平对比

2.2 各组大鼠血清抗炎因子水平对比

血清IL-2、IL-10水平，模型组低于对照组，当归芍药散组与阿奇霉素组无差异但均高于模型组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清抗炎因子水平对比

2.3 各组子宫组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达比较

子宫组织内NF-κBp50蛋白、NF-κBp65蛋白水平，模型组高于对照组，当归芍药散组与阿奇霉素组无差异但均低于模型组(均P<0.05)。见图1、表3。

表3 各组子宫组织中 NF-κB 信号通路相关蛋白表达比较

图1 Western blotting NF-κB表达

3 讨论

在妇科疾病中CPID病情较为顽固且发病率较高，主要由急性盆腔炎未彻底治疗的迁延、滥用抗生素、病菌感染等因素造成，易造成月经失调、白带异常甚至不孕等不良症[8-9]。CPID发病和治疗均与患者机体免疫相关，因此目前治疗多采用抗生素。但长期使用抗生素将出现耐药性或其他一系列病菌反复感染问题，对患者长期疗效不利[10]。探究新的治疗方法对CPID临床治疗尤为重要。

中医学上，CPID相关的病症主要归入“月经不调”、“妇人腹痛”、“不孕”等范畴中，目前临床采用当归芍药散中医药方治疗。当归芍药散顾名思义，内含当归和芍药，另有茯苓、泽泻、川芎、白术等主要成分，其中当归、芍药、川芎可舒肝益血，茯苓、白术、泽泻可健脾祛湿，诸药合用共同达到益气活血的功效[11-12]。当归芍药散主要出自《金匮要略》[13]的“妇人妊娠病脉证篇”，论道：“妇人怀妊，腹中疠痛，肝脾不和之证，重用芍药以敛肝止痛，白术、茯苓健脾益气，合泽泻淡渗利湿，佐当归、川芎调肝养血...诸药合用，共奏肝脾两调，补虚渗湿之功。”《宋·太平惠民和剂局方》也有关于当归芍药散治疗女性产后血晕，内虚气乏等观点，而《青州医谈》则直称该药方可妊中保胎。

从病理来看，CPID在治疗过程中，子宫内炎性因子水平和免疫机制的平衡至关重要。炎性因子包括促炎因子和抗炎因子，其合成和分泌与免疫细胞息息相关。当机体局部出现炎症反应时，巨噬细胞和单核细胞等分泌IL-6、IL-8等促炎因子，局部IL-6、IL-8水平明显升高。同时IL-8结合趋化因子受体对中性粒细胞产生趋化作用，调节局部炎症状态[14-15]。TNF-α可产生粘附因子并作用于血管内皮细胞，损伤血管功能或形成血栓，同时还有提高中性粒细胞的吞噬能力，聚集局部炎性因子，进一步恶化局部炎症状态，损伤血管屏障。IL-2、IL-10为抗炎因子，IL-2可促进淋巴细胞的生长、增殖、分化过程，同时还能活化T细胞，加快启动免疫机制；IL-10是公认的炎症与免疫抑制因子，与特异性受体结合后通过调节免疫细胞生长、分化参与局部炎性因子抑制。本研究中，模型组、当归芍药散组、阿奇霉素组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于对照组，模型组血清IL-2、IL-10水平低于对照组；当归芍药散组、阿奇霉素组血清IL-6、IL-8、TNF-α水平低于模型组，IL-2、IL-10水平高于模型组。说明，CPID大鼠机体存在较明显的炎症状态，但经过当归芍药散或阿奇霉素治疗后，机体免疫机制得到有效调节，局部炎性因子均显著抑制[16]。但当归芍药散组和阿奇霉素组上述指标无明显差异，表明当归芍药散的炎症抑制效果和免疫调节改善效果也较好，与目前临床常用的阿奇霉素无明显差异。

NF-kB是一种蛋白质复合物，最常见的为p50/p65二聚体。当炎性因子、TNF-α等与特异性受体结合后，NF-kB可从不同通路下激活激酶并磷酸化，促使NF-kB从细胞质复合物中释放，进入细胞核调节转录靶基因，进而促进炎症反应，抑制细胞凋亡[17]。本研究中，模型组大鼠子宫组织NF-κBp50蛋白、NF-κBp65蛋白水平高于对照组、当归芍药散组和阿奇霉素组，而当归芍药散组和阿奇霉素组无差异。表明，CPID大鼠子宫组织内NF-kB信号相关蛋白表达活跃，而当归芍药散可能通过抑制或阻断NF-kB信号转导达到抗炎的效果，进而改善CPID大鼠免疫状态。

综上所述，当归芍药散可通过抑制CPID大鼠NF-kB信号相关蛋白表达，降低机体局部炎症，改善机体免疫状态。此外，本研究仅从模型组和当归芍药散、阿奇霉素角度分析CPID大鼠的炎症状态，未对当归芍药散的使用剂量、时机等深入分析。因此，为探究当归芍药散最佳临床疗效，还需扩大样本，改变分组依据，深入分析不同当归芍药散用量对CPID大鼠炎症因子的影响。