下调miRNA-217对UVB诱导人皮肤成纤维细胞氧化损伤及Sirt1/FOXO1通路的影响*

安 庆，惠 坤，朱东宁

(1.西北大学附属医院/西安市第三医院皮肤科,西安 710018；2.陕西省中医医院皮肤科,西安 710003；3.西北妇女儿童医院皮肤科,西安 710061)

皮肤是保护人体免受有毒化学物质污染和紫外线辐射的第一道防线[1]。中波紫外线(ultraviolet B，UVB，280～320 nm)能够穿透表皮到达真皮上层，造成皮肤DNA和氧化应激损伤[2-3]。此外，UVB辐射能够提高皮肤光老化和致癌风险[4]。研究显示，微RNA(microRNA，miRNA)是19～24个核苷酸的非编码RNA，可参与调控UVB造成的皮肤细胞损伤过程[5]。胡翠等[6]研究显示，miRNA-1246靶向抑制丝裂原活化蛋白激酶14参与调控皮肤成纤维细胞增殖活性。毛丽艳等[7]研究报道，miRNA-26a靶向调控组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2调控长波紫外线(ultraviolet A,UVA)照射诱导皮肤成纤维细胞增殖活性，影响细胞光老化。有研究发现，在皮肤成纤维细胞中，miRNA-217过度表达能够促进细胞衰老[8]。沉默信息转录调节因子1(silent information transcription regulator 1，Sirt1)/叉形头转录因子1(forkhead transcription factor 1，FOXO1)途径与细胞氧化应激水平密切相关[9]，但miRNA-217与人皮肤成纤维细胞(human foreskin fibroblasts，HFF)的UVB辐射损伤及其与Sirt1/FOXO1关系尚不清楚。本研究拟通过UVB损伤HFF-1模型，探讨miRNA-217对HFF-1细胞损伤的影响机制，为临床预防皮肤疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1主要材料

HFF-1(SCSP-109)来源于中国科学院细胞库；杜氏改良Eagle培养基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培养液(11995)、细胞凋亡试剂盒(CA1020)、过氧化氢酶(catalase，CAT，BC0200)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，BC0170)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，BC0025)试剂盒、胎牛血清(11011-6123)、细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8，CA1210)、放射免疫沉淀试验(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(R0010)、逆转录试剂盒(T2210-200T)均购自北京索莱宝有限公司；miRNA-217 抑制剂、miRNA-217 阴性对照(negative control，NC)由广州锐博生物生物技术有限公司设计；2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-dichlorofluorescein yellow diacetate，DCHF-DA，D399)、Sirt1(PA5-17074)和FOXO1(82358)兔抗人多克隆抗体、β-肌动蛋白(β-actin，MII0201)小鼠抗人单克隆抗体、山羊抗兔(A32731)和山羊抗小鼠lgG(H+L)二级抗体(A32723)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要仪器

HF160W型CO2细胞培养箱购自上海Heal Force公司；EVOS M5000细胞成像系统、ProFlex型PCR仪(ProFlex)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；WD-9413C型凝胶成像分析系统购自上海添时科学仪器有限公司；ELX-8081U型酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

将HFF-1细胞培养于含有10%(V/V)胎牛血清、1%(V/V)双抗的DMEM培养基，置于37 ℃、5%(V/V)CO2环境中培养至3～5代，收集细胞用于后续实验。

1.2.2UVB照射及实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)实验

参照文献[10]方法照射HFF-1细胞1、2、3、4 d后设置为UVB组，另取HFF-1细胞作为正常组。根据RNA试剂盒说明书提取各组总RNA，逆转录获得cDNA，PCR扩增后，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miRNA-217相对表达水平。反应条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火，延伸30 s，40个循环。miRNA-217和U6由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表1。

表1 miRNA-217和U6引物序列

1.2.3细胞分组及转染

将HFF-1细胞分为对照组、miRNA-217 NC组和miRNA-217 抑制剂组，根据转染试剂盒操作说明转染miRNA-217 NC组和miRNA-217 抑制剂组，12 h后更换为新鲜培养液孵育6 h，参照1.2.2对各组进行连续3 d的UVB照射，并检测miRNA-217表达水平。

1.2.4CCK-8实验

将细胞接种于96孔板(5.0×104个/孔)，分组处理后，按照CCK-8说明书测量各孔吸光值(A)，计算细胞活力(%)。细胞活力(%)=[A(转染)-A(调零孔)]/[A(未转染)-A(调零)]×100%。

1.2.5凋亡实验

根据试剂盒说明书处理1.2.3各组细胞后，流式细胞仪检测凋亡变化，计算凋亡率。凋亡率=凋亡早期细胞比例+凋亡晚期细胞比例。

1.2.6活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测

将各组细胞经磷酸盐缓冲盐溶液清洗后，加入DCHF-DA探针，避光保存15 min，无血清培养基清洗后，荧光显微镜下(λEx=488 nm，λEm=525 nm)观察并记录。

1.2.7CAT、SOD和MDA检测

根据CAT、SOD和MDA试剂盒说明书步骤，检测各组上述指标水平。

1.2.8Western blot检测

RIPA提取总蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测蛋白总浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、转膜、封闭1 h后，加入一抗Sirt1、乙酰化FOXO1(Ac-FOXO1)、FOXO1和β-actin(1∶1 000)，4 ℃过夜，加入二抗(1∶10 000)，曝光显影，分析条带。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 UVB照射后miRNA-217表达变化

与正常组比较，相同时间时，UVB组miRNA-217表达水平明显升高(P<0.05)；与UVB组照射1 d比较，UVB组照射2、3、4 d后细胞中miRNA-217表达水平依次升高(P<0.05)。因3、4 d增幅缩小，差异无统计学意义(P>0.05)，故选取UVB照射3 d进行后续实验。各组细胞miRNA-217表达水平比较，见表2。

表2 正常组与UBV组细胞miRNA-217表达水平比较

2.2 转染后UVB诱导的HFF-1细胞miRNA-217表达水平

与正常组比较，对照组miRNA-217表达水平明显升高(1.03±0.08vs.2.52±0.08，P<0.05)；与对照组和miRNA-217 NC组比较，miRNA-217 抑制剂组miRNA-217表达水平明显降低(2.52±0.08vs.1.14±0.03，2.48±0.07vs.1.14±0.03，P<0.05)。

2.3 各组HFF1细胞存活率比较

与正常组比较，对照组细胞存活率明显降低[(100.00±5.23)%vs.(51.29±3.46)%，P<0.05]；与对照组和miRNA-217 NC组比较，miRNA-217 抑制剂组细胞存活率明显升高[(51.29±3.46)%vs.(83.94±3.91)%，(48.73±4.82)%vs.(83.94±3.91)%，P<0.05]。

2.4 各组HFF1细胞凋亡率比较

与正常组比较，对照组细胞凋亡率明显升高[(2.06±0.68)%vs.(13.86±1.14)%，P<0.05]；与对照组和miRNA-217 NC组比较，miRNA-217 抑制剂组细胞凋亡率明显降低[(13.86±1.14)%vs.(3.13±0.95)%，(12.56±1.70)%vs.(3.13±0.95)%，P<0.05]；对照组与miRNA-217 NC组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 流式细胞仪检测各组HFF1细胞凋亡情况

2.5 各组HFF1细胞ROS水平比较

与正常组比较，对照组HFF-1细胞中ROS水平明显升高(P<0.05)；与对照组和miRNA-217 NC组比较，miRNA-217 抑制剂组HFF-1细胞中ROS水平明显降低(P<0.05)；对照组与miRNA-217 NC组ROS水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。荧光显微镜下观察各组HFF-1细胞ROS水平，见图2。

图2 荧光显微镜下观察各组HFF-1细胞ROS水平(绿色荧光代表ROS水平，×200)

2.6 各组HFF-1细胞CAT、SOD和MDA水平比较

与正常组比较，对照组细胞CAT和SOD活性明显降低(P<0.05)，MDA水平明显升高(P<0.05)；与对照组和miRNA-217 NC组比较，miRNA-217 抑制剂组细胞CAT和SOD活性明显升高(P<0.05)，MDA水平明显降低(P<0.05)；对照组与miRNA-217 NC组上述指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组HFF-1细胞CAT、SOD活性和MDA水平比较

2.7 各组HFF1细胞Sirt1、Ac-FOXO1和FOXO1表达水平比较

与正常组比较，对照组HFF-1细胞Sirt1和FOXO1蛋白表达明显降低(P<0.05)，Ac-FOXO1蛋白表达和Ac-FOXO1/FOXO1比值明显升高(P<0.05)；与对照组和miRNA-217 NC组比较，miRNA-217 抑制剂组HFF-1细胞Sirt1和FOXO1蛋白表达明显升高(P<0.05)，Ac-FOXO1蛋白表达和Ac-FOXO1/FOXO1比值明显降低(P<0.05)；对照组与miRNA-217 NC组上述指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3，表4。

A：正常组；B：对照组；C：miRNA-217 NC组；D：miRNA-217抑制剂组。

表4 各组HFF1细胞Sirt1、Ac-FOXO1和FOXO1蛋白表达水平比较

3 讨 论

紫外线长时间照射是引起皮肤损伤的主要因素之一，近年来研究发现，miRNA在皮肤细胞代谢、衰老、癌变中起着至关重要的作用。miRNA-186-5p通过抑制Twist相关蛋白1蛋白表达诱导HFF1衰老，miRNA-186-5p可能是干预皮肤老化的潜在靶点[11]。miRNA-22-3p在皮肤鳞状细胞癌细胞中低表达，其过表达通过调控结构蛋白家族1蛋白表达致癌细胞增殖，促进其凋亡[12]。吴林燕等[13]研究显示，miRNA-217在瘢痕疙瘩成纤维细胞中高表达，抑制miRNA-217调控DNA 甲基转移酶 1蛋白表达可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡。本研究结果显示，随UVB照射时间的延长，HFF-1细胞中miRNA-217表达逐渐增加，与文献[6]研究结果一致，提示UVB照射后HFF-1细胞中miRNA-217异常高表达。与正常组比较，对照组细胞中miRNA-217表达明显升高，细胞存活率明显降低，凋亡率明显升高。提示UVB长时间照射后引起HFF-1细胞损伤且可能与细胞中miRNA-217异常表达有关。

UVB长时间照射造成皮肤细胞损伤与皮肤抗氧化系统紊乱有关。ROS参与机体氧化应激反应，UVB引起皮肤细胞损伤后ROS分泌水平增加，清除率低[14]。抗氧化酶CAT和SOD为细胞抗氧化防御体系的重要物质，对机体氧化动态平衡至关重要[15]。MDA是细胞氧化程度和受损的重要标志[16]。有研究显示，提高皮肤组织中SOD、CAT的活力，降低MDA水平、清除ROS可有效地减轻紫外线照射引起的皮肤损伤[17]。miRNA-217在氧化应激诱导的内皮细胞凋亡中被明显上调[18]。在高糖诱导的足细胞中，阻断miRNA-217表达可以减轻高糖对足细胞活力不利作用，并抑制ROS水平和细胞凋亡，从而拮抗细胞损伤[19]。本研究发现，miRNA-217 抑制剂干预后，HFF-1细胞存活率及CAT、SOD活性明显升高，细胞凋亡率、MDA水平明显降低，提示下调miRNA-217能够提高UVB诱导下HFF-1细胞的抗氧化能力。

Sirt1是一种组蛋白脱乙酰基酶，能够促进FOXO1脱乙酰化发挥抗氧化应激作用[20]。MO等[21]研究发现，使用Sirt1激活剂能够促进FOXO1核表达，逆转脂多糖诱导的鼠胰岛细胞氧化损伤；在低密度脂蛋白引起血管内皮细胞损伤中，激活Sirt1/FOXO1可以提高细胞的抗氧化能力[22]。此外，体内外实验证明，心肌缺血再灌注损伤的心肌细胞或心脏中Sirt1上调，FOXO1乙酰化下调有利于抑制细胞凋亡和氧化应激反应[23]。本研究结果显示，miRNA-217 抑制剂干预后，Sirt1/FOXO1通路被激活，Ac-FOXO1水平明显降低，提示下调miRNA-217可能通过激活Sirt1/FOXO1途径，抑制UVB诱导的HFF-1细胞氧化应激反应。MENGHINI等[24]证实，miRNA-217能够靶向促进Sirt1表达，降低FOXO1乙酰化，抑制人脐静脉内皮细胞衰老，因此，推测下调miRNA-217水平可能通过靶向促进Sirt1蛋白表达，抑制FOXO1乙酰化，减轻UVB诱导所致HFF-1细胞氧化应激损伤。

综上所述，下调miRNA-217可抑制UVB诱导的HFF-1细胞凋亡，降低氧化应激，这可能与激活Sirt1/FOXO1信号通路相关，表明miRNA-217可能是预防UVB引起的皮肤疾病的潜在靶标。然而，光损伤作为皮肤病的主要环境因素，其机制复杂，因此，仍需进一步联合动物模型和临床试验进行探讨。