QuEChERS/气相色谱-串联质谱法测定化妆品中10种N-亚硝胺类化合物

张 静，曾敏珊，赖俊敏，李思源，严小红，丁 怡

（广州市药品检验所，广东 广州 510160）

亚硝胺类化合物具有致癌或潜在致癌风险［1］。我国《化妆品安全技术规范》（2015 年）与欧盟化妆品法规（2009 年）均将亚硝胺类化合物列入禁用目录，并规定化妆品原料中亚硝胺类杂质不得超过50 μg/kg［2-3］。欧盟消费者安全科学委员会（Scientific Committee on Consumer Safety，SCCS）近年来陆续通报在化妆品中检出超限的亚硝胺类化合物［4-5］。

亚硝胺通常痕量存在于化妆品中，对方法的灵敏度要求极高，因此选择合适的检测方法尤为重要。热能分析仪对亚硝胺结构具有检测特异性，是检测亚硝胺的专属仪器［6］。近年来，随着质谱技术的迅速发展，质谱联用技术成为亚硝胺测定的主要方法。目前文献报道的检测方法多为液相色谱-质谱法［7-9］和气相色谱-质谱法［10-12］，其中采用气相色谱-质谱法测定挥发性亚硝胺具有更高的灵敏度，成为最主要的检测手段之一。但实际检测过程中发现，气相色谱-质谱法测定化妆品中的亚硝胺存在以下不足：（1）专属性不强，大多文献［10-12］选择响应最高的离子作为监测对象，但化妆品基质复杂，干扰组分较多，某些化合物响应最大的离子受到的干扰也最大，反而降低了方法的专属性和灵敏度；（2）前处理繁琐，耗时较长，易使挥发性亚硝胺损失，从而导致灵敏度下降。例如GB/T 29669-2013［10］中采取固相萃取后氮吹浓缩的方法，方法检出限为1.25～5.0 mg/kg，不能满足我国《化妆品安全技术规范》（2015年）对亚硝胺类杂质含量不得超过50 μg/kg 的限量要求；（3）前处理操作复杂，难以保证准确度和精密度。Dong等［11］采用的液液萃取后氮吹浓缩的方法，需严格控制氮气吹干程度，才能保证较好的精密度。

本研究旨在建立更加简便准确的化妆品中亚硝胺含量的气相色谱-串联质谱测定方法，着重解决以下问题：（1）针对化妆品的干扰特点，优化气相色谱、质谱条件，提高专属性；（2）优化前处理条件，采用QuEChERS 前处理方法简化操作，提高准确度、精密度和灵敏度，以满足我国《化妆品安全技术规范》（2015年）中痕量分析的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B 气相色谱仪和7010B 三重四极杆质谱仪（美国Agilent 公司）；涡旋混合仪（德国IKA 公司）；ST16R 离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管、EMRLipid Polish反萃管、陶瓷均质子（美国Agilent公司）。

乙腈（色谱纯，德国默克公司）；NaCl（分析纯，广州化学试剂厂）；实验用水为一级水。

10 种亚硝胺标准储备液的质量浓度为100 μg/mL 或1 000 μg/mL，购自曼哈格公司。化妆品样品均为市售产品。

1.2 实验方法

1.2.1 气相色谱条件色谱柱：聚乙二醇石英毛细管柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：40 ℃保持0.5 min，以15 ℃/min 升温至190 ℃后，再以40 ℃/min 升温至250 ℃，保持13 min；进样口温度：250 ℃；进样体积：1.0 μL；不分流进样；流速：1.0 mL/min；载气：氦气。

1.2.2 质谱条件离子源：电子轰击离子源（EI）电压为-70 eV；传输线温度：250 ℃；离子源温度：250 ℃；碰撞气：氩气；测定方式：多反应监测（MRM）模式。10种亚硝胺类化合物的保留时间、定性、定量离子和碰撞能等参数见表1。

表1 10种N-亚硝胺类化合物的分子式、CAS号、保留时间、母离子、子离子和碰撞能量Table 1 Formulas，CAS No.，retention times，parent ions，product ions and collision energies（CEs）of the 10 N-nitrosamines

1.3 标准溶液的制备

分别精密量取10 种亚硝胺标准储备液适量，用乙腈稀释定容制成10 μg/mL 的混合标准溶液，于4 ℃冰箱避光保存。取混合标准溶液适量，逐级稀释制得质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 ng/mL的系列标准溶液，置于棕色进样瓶中，备用。

1.4 供试品溶液的制备

称取样品1 g（精确至0.001 g）于15 mL 具塞离心管中，加入5 mL 乙腈，在涡旋混合仪上振荡提取5 min，以8 000 r/min离心3 min，上清液待净化。

向15 mL EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管中加入5 mL水，涡旋混匀3 s活化。取全部上清提取液加入活化好的EMR-Lipid dSPE 增强型脂质去除净化管中，涡旋混合1 min，以8 000 r/min 离心3 min；取全部上清提取液加入15 mL EMR-Lipid Polish反萃管中，涡旋振荡1 min，以8 000 r/min离心3 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

一般来说，多反应监测模式（MRM）的专属性及灵敏度均优于选择离子监测模式（SIM），故选择MRM 模式进行检测。文献多采用响应大的离子对作为监测目标，但是化妆品基质复杂，干扰较多，响应最大的离子对专属性不一定最强。以N-亚硝基吡咯烷（NPYR）为例，文献采用的监测离子对多为m/z100→55 和m/z100→43，其响应高，有利于提高灵敏度。但在实际样品测定过程中发现，不同基质的化妆品均对上述离子对有很强的干扰，反而造成专属性及灵敏度下降。对10种亚硝胺进行一级扫描和二级扫描，筛选出响应较强且不易受干扰的子离子对m/z100→70 和m/z100→68 作为监测离子对，可兼顾专属性及灵敏度的要求。

2.2 气相色谱条件的优化

亚硝胺化合物的极性不同，且差异较大。Dong等［11］考察了HP-INNOWAX、DB-5MS对化妆品中13 种亚硝胺的色谱行为，陈丽香等［13］考察了HP-INNOWAX、DB-1701、HP-5MS 对水产干制品中9 种亚硝胺的色谱行为，结果均表明HP-INNOWAX 对亚硝胺具有更好的峰形、分离度和重复性，尤其是对极性强、分子量最小的NDMA 有较好的保留，从而可排除基质带来的干扰。本实验分别考察了10 种亚硝胺化合物在HP-INNOWAX（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）、VF-1301MS（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）上的色谱行为。结果表明，HP-INNOWAX 具有更尖锐的峰形和灵敏度，与文献结果一致。因此选择HP-INNOWAX 作为分析色谱柱。上述文献均将50 ℃作为程序升温的初始温度，实际化妆品样品测定过程中发现，该温度下NDMA 保留时间附近有较大干扰峰，对定量造成影响，选择40 ℃作为程序升温的初始温度可使分离度更好，提高定量的准确度。通过优化流速、升温速率，10 种亚硝胺获得较好的分离效果且灵敏度较高。图1为10种亚硝胺的总离子流色谱图。

图1 10种N-亚硝胺类化合物（50 ng/mL）的总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of the 10 N-nitrosamines（50 ng/mL）

2.3 前处理方法优化

化妆品基质复杂，一般含有大量油脂性物质和表面活性剂，且上述10 种亚硝胺的极性差异也较大。GB/T 29669-2013 采用不同溶剂对不同基质的化妆品进行提取，经固相萃取净化后氮吹浓缩。Dong等［11］发现乙腈具有提取不同极性亚硝胺的能力，同时对化妆品中的油脂性物质溶解性较小，是理想的提取溶剂。因此本文考察了乙腈直接提取法、盐析辅助液液萃取法（水+乙腈+氯化钠）、固相萃取法（采用HLB、Florisil、ENVI-Carb 3 种固相萃取小柱）的提取效果，结果表明盐析辅助液液萃取法可获得最佳提取效果，但该方法需通过氮吹浓缩达到灵敏度要求。而实际操作中，氮吹耗时较长，且易导致NDMA损失，影响定量结果的准确度和精密度。

QuEChERS 法是基于液液萃取和分散固相净化提取的快速前处理技术，具有快速、简便、低廉、有效、稳定和安全的优点，主要用于农药残留检测［14］。近年来QuEChERS 法的应用范围不断增加，可测定更多种类的化合物［15-17］。增强型脂质去除净化管可有效去除非极性杂质，提高结果的准确度和灵敏度。本实验采用QuEChERS 前处理方法，样品经乙腈提取后，采用EMR-Lipid dSPE 净化管去除脂类等非极性杂质，再经EMR-Lipid Polish 反萃管除水，上清液直接过滤测定，避免了氮吹处理，提高了精密度。将本方法与已有文献方法进行比较，发现在空白样品中添加50 μg/kg 的亚硝胺时，GB/T 29669-2013 方法耗时最长，NDMA、NDEA、NPYR、NMorPh 的回收率低于80%，其中NDMA 的回收率仅30%（可能由于氮吹时间过长导致）；使用盐析辅助液液萃取法［11］时多数亚硝胺的回收率与本方法接近，但精密度较差，且其中NDBzA 在香波类样品中的回收率不足10%（可能与基质有关）。故选用QuEChERS前处理方法可获得更准确灵敏的结果。

2.4 方法学确证

2.4.1 专属性分别精密量取乙腈溶剂空白、对照品溶液（10 ng/mL）、空白样品溶液、空白样品加标溶液，按照“1.2.1”和“1.2.2”条件进样测定，记录色谱图。结果显示10种亚硝胺均无干扰，专属性良好。

2.4.2 线性关系、检出限与定量下限对“1.3”部分的系列标准溶液进行分析，以峰面积（y）为纵坐标，对应的质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。结果表明，10 种亚硝胺在0.5～50 ng/mL 范围内线性良好，相关系数（r）为0.999 8～1.000 0。分别以定量离子信噪比（S/N）为3和10时的响应为方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到LOD为1 μg/kg，LOQ为3 μg/kg。

2.4.3 准确度与精密度取水、乳、膏霜、油、粉空白样品，分别添加3 个水平（5、50、200 μg/kg）的10 种亚硝胺标准溶液，按“1.4”方法进行处理，每个水平重复6 次，计算加标回收率。结果表明，10种亚硝胺的平均回收率为80.5%～143%，相对标准偏差（RSD）小于11%（n=6），见表2。其中多数化合物的平均回收率在80.0%～120%之间，个别化合物回收率较高，可能是由基质效应导致，稀释供试品溶液或采用基质标准曲线校正，可提高准确度。

表2 化妆品中10种N-亚硝胺类化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations of the 10 N-nitrosamines in cosmetics（n=6）

2.4.4 基质效应（ME）采用萃取空白样品基质后添加标准物质的方法考察基质效应：配制质量浓度为10、40 ng/mL 的基质溶液及相同浓度的标准溶液，在相同条件下进行分析，参考文献［18］公式ME =（Pm/Ps-1）×100%计算ME。其中，Ps和Pm分别为标准溶液和含同浓度标准物质的基质溶液中亚硝胺的响应值。当ME=0 时，表示没有基质效应；当ME＜0 或ME＞0 时，分别表示基质抑制或增强效应。结果表明，ME 为-18.9%～24.0%（n=6），说明10 种亚硝胺在水、乳、膏霜、油、粉5 种不同基质化妆品中表现出较为显著的基质效应，这可能是个别化合物回收率偏高的原因。

2.5 实际样品检测

采用本方法对抽取的水、乳、膏霜、油、粉5 种不同基质的37 批市售化妆品进行检测。其中1 份沐浴露和1份洗发露样品检出NDPhA，含量分别为5.6、8.0 μg/kg，其他组分均未检出。阳性样品的MRM 提取离子色谱图如图2所示。

图2 阳性样品的提取离子色谱图Fig.2 Extraction ion chromatogram of a positive sample

3 结 论

本文采用QuEChERS前处理方法结合GC-MS/MS对化妆品中的10种亚硝胺进行定性定量分析。方法操作简便、快速，专属性强，灵敏度高，精密度、准确度均较好，可应用于水、乳、膏霜等不同化妆品基质中10 种亚硝胺的测定，为化妆品中亚硝胺的风险评估提供了技术支持。