超高效液相色谱-串联质谱法快速筛查药用胶塞中12种抗氧剂

余秋玲，张永梅，邱 月，秦 瑶，龙 梅

（重庆市计量质量检测研究院，重庆 401123）

胶塞是药品包装材料中重要的密封组件，具有弹性好、抗腐蚀性强等优点，通常需加入抗氧剂以抑制或延缓其氧化［1］。药用胶塞主要用于西林瓶、预灌封注射器、笔帽式注射器等［2-3］。绝大多数情况下，药品与胶塞直接接触，胶塞中的抗氧剂会迁移至药品中［4］，从而对患者的身体健康构成威胁。《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）》［5］明确指出，热塑性弹性体在共混时一般会加入抗氧剂，须在相容性实验中予以重点关注。因此，建立药用胶塞中多种抗氧剂的检测方法十分必要。

目前抗氧剂的检测方法主要有液相色谱法［6-7］、液相色谱-串联质谱法［8］、气相色谱-质谱联用法［9-10］和超临界流体色谱法［11］等。其中，液相色谱法应用范围最广，但检测时间较长、检出限较高；气相色谱-质谱联用法无法对高沸点抗氧剂（如抗氧剂168 等）进行分析，适用范围窄；超临界流体色谱法对仪器硬件要求较高，限制了其广泛应用［12］。液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）集质谱的高选择性、高灵敏度和液相色谱的高分离能力于一体，在现代分析领域中具有广泛应用。胡佩等［13］采用高效液相色谱-串联质谱法同时检测药品包装中9 种抗氧剂，但分析时间长达30 min；董犇等［14］采用超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测食品接触材料及制品中9种抗氧剂，分析时间约8 min，但其方法检出限为0.1 mg/L，灵敏度相对较低。程畅等［15］采用液相色谱-串联质谱法检测食品接触橡胶密封垫圈中7 种抗氧剂，分析时间约15 min。综上，目前报道的检测抗氧剂的液相色谱-串联质谱方法普遍存在能同时检测的抗氧剂种类少、灵敏度较低或分析效率低等问题。

本研究基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术建立了药用胶塞中12种抗氧剂的检测方法。该方法前处理简单，灵敏度高，定性定量准确，可在6 min 内实现12 种抗氧剂的同时检测，为药品与包材相容性实验中抗氧剂的快速筛查提供了技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-串联质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；SQP 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；电热恒温培养箱（上海森信试验仪器有限公司）；Lab Dancer涡旋混合仪（德国IKA公司）。

抗氧剂1024（99.6%）、抗氧剂1035（98.0%）、抗氧剂1222（97.5%）、抗氧剂1425（98.4%）、抗氧剂300（95.0%）、抗氧剂702（98.7%）、抗氧剂BBM（99.8%）、抗氧剂168（99.8%）均购于广州佳途科技有限公司；抗氧剂3114（99.9%）购于美国Accustandard 公司；抗氧剂BHT-COOH（98%）购于河北百灵威超精细材料有限公司；抗氧剂1310（99.4%）、抗氧剂330（99.5%）均购于北京曼哈格生物科技有限公司。以上12种抗氧剂的化学文摘登记号（CAS）、分子式和分子量等信息见表1。乙腈、甲醇、甲酸（均为质谱级）购于上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸铵（质谱级）购于上海麦克林生化科技有限公司；乙醇（色谱纯）购于Fisher Chemical 公司；二氯甲烷（色谱纯）购于霍尼韦尔贸易有限公司；氯化钠（分析纯）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）针式滤膜购于日本岛津公司。

表1 12种抗氧剂的简称、化学文摘登记号、分子式和分子量Table 1 Synonyms，CAS，molecular formulas and molecular weights of 12 antioxidants

1.2 标准溶液的配制

分别精密称取各标准品25 mg（精确至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，加适量二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。分别准确移取一定体积的标准储备液，用乙腈稀释成抗氧剂BBM 和抗氧剂1310 的质量浓度为5 000 ng/mL，抗氧剂168 为4 000 ng/mL，抗氧剂3114 为2 000 ng/mL，其余各物质的质量浓度为1 000 ng/mL 的中间液。再用乙腈将上述中间液稀释成抗氧剂BBM 和抗氧剂1310的质量浓度分别为25、50、100、250、375、500 ng/mL，抗氧剂168 分别为20、40、80、200、300、400 ng/mL，抗氧剂3114 分别为10、20、40、100、150、200 ng/mL，其余各物质的质量浓度分别为5、10、20、50、75、100 ng/mL的标准工作溶液。

1.3 样品前处理

将药用胶塞剪成小碎片（单个质量≤0.2 g），称取20 g（精确至0.1 mg）置于带盖试剂瓶中，加入20%乙醇溶液100 mL，在60 ℃条件下浸泡72 h，冷却至室温，过滤即得胶塞的提取液。准确移取2.0 mL 提取液于10 mL 比色管中，再加入2.0 mL 乙腈，涡旋摇匀，加入1.0 g 氯化钠，充分涡旋振荡萃取，静置分层，取上层清液过0.22 μm PTFE滤膜，取续滤液上机测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：Hypersil Gold C8（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；流动相：A 为0.02%甲酸和5 mmol/L 甲酸铵水溶液，B 为甲醇；柱温为45 ℃；进样体积为3 μL；流速为0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～0.2 min，70% B；0.2～2 min，70%～98% B；2～6 min，98% B；6～6.5 min，98%～70% B；6.5～7.5 min，70%B。

1.4.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子模式：正、负离子模式；扫描模式：多反应监测（MRM）；气帘气：206.8 kPa；离子源温度：500 ℃；喷雾气和辅助加热气：344.7 kPa。12种目标化合物的母离子、子离子、碰撞能、离子模式和保留时间见表2。

表2 12种抗氧剂的母离子、子离子、去簇电压、碰撞能量、离子模式和保留时间Table 2 Parent ions，daughter ions，declustering potentials，collision energies，polarities and retention times of 12 antioxidants

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

分别考察了XSelect HSS T3（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Hypersil Gold C8（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）3种色谱柱对12种抗氧剂分离效果的影响。结果表明，使用XSelect HSS T3色谱柱时，极性较弱的抗氧剂330和抗氧剂168不出峰；使用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱时，抗氧剂168 有色谱柱残留；使用Hypersil Gold C8色谱柱时，12种抗氧剂均能正常出峰，分离效果较好且无色谱柱残留。原因可能是XSelect HSS T3 和ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱对弱极性化合物的保留较强，导致弱极性化合物难以被洗脱下来，而Hypersil Gold C8色谱柱固定相的碳链更短，对弱极性化合物的保留较弱，使其更容易被洗脱下来，从而避免色谱柱残留。因此选择Hypersil Gold C8色谱柱进行分离，12 种抗氧剂（质量浓度约为100～500 ng/mL）在正、负离子模式下的总离子流图（TIC）见图1。由图可知，12种抗氧剂在6 min内得到有效分离。

图1 12种抗氧剂在正、负离子模式下的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of 12 antioxidants the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 流动相的优化

流动相是影响色谱峰峰形、分离度及峰面积的重要因素。由于抗氧剂BBM 的母离子为加氨离子，为最大程度提高其响应强度，在水相中加入5 mmol/L 甲酸铵；此外，为改善抗氧剂1310的峰形，将流动相调至酸性［7］，考察了甲酸体积分数在0～0.08%范围内对抗氧剂1310 峰形和抗氧剂BBM 峰面积的影响（图2）。结果表明，不加入甲酸时，抗氧剂1310 的峰形展宽；随着甲酸体积分数的增大，抗氧剂BBM 的响应强度逐渐减小，因此选择甲酸体积分数为0.02%。最终选择0.02%甲酸和5 mmol/L 甲酸铵水溶液作为水相，甲醇作为有机相。

图2 甲酸体积分数对抗氧剂1310峰形（A）和抗氧剂BBM峰面积（B）的影响Fig.2 Effects of formic acid volume fraction on the peak shape of antioxidant 1310（A）and the peak area of antioxidant BBM（B）

2.3 质谱条件的优化

采用流动注射泵连续进样方式，分别在ESI＋、ESI-模式下对12 种抗氧剂的单标溶液（质量浓度约为500 ng/mL）进行全扫描确定母离子；然后根据母离子分别对其子离子进行扫描，选取丰度最大的2 个子离子，以丰度较大的为定量离子，另一个则为定性离子；最后进行去簇电压和碰撞能的优化。12种抗氧剂的最佳质谱参数见表2。

2.4 线性关系、检出限与定量下限

按照“1.2”配制12 种抗氧剂的系列标准工作溶液，在最优条件下上机测定，以各抗氧剂的质量浓度为横坐标（x，mg/L），对应的定量离子峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，建立线性方程。选取阴性药用胶塞样品进行加标，按照“1.3”进行前处理后上机测定，分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）确定各抗氧剂的方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。结果显示，12种抗氧剂在各自质量浓度范围内线性良好，相关系数（r2）均大于0.995，LOD、LOQ 分别为0.10～25 ng/g和0.25～75 ng/g（见表3）。

表3 12种抗氧剂的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量下限Table 3 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of 12 antioxidants

2.5 回收率与相对标准偏差

选取阴性药用胶塞样品分别进行3 个浓度水平的加标实验，每个浓度水平进行6 次平行实验。由表4 可知，12 种抗氧剂的平均加标回收率为75.6%～117%，相对标准偏差（RSD）为0.90%～8.4%，表明该方法具有良好的准确度与精密度，能够满足实际检测要求。

表4 12种抗氧剂的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 12 antioxidants（n=6）

2.6 实际样品检测

采用本方法对10 种市售药用胶塞中的目标抗氧剂进行筛查，结果表明，抗氧剂1310 和抗氧剂BHT-COOH 有检出，其余抗氧剂均未检出。其中，9 种药用胶塞中检出抗氧剂1310，检出量为1.0～5.0 mg/kg；3种药用胶塞中检出抗氧剂BHT-COOH，检出量为0.02～0.09 mg/kg。若药品采用上述阳性胶塞作为包装材料，则胶塞中抗氧剂1310 或抗氧剂BHT-COOH 存在向药品中迁移的风险，需在后续的迁移实验中进行监测。

3 结 论

本文通过对色谱柱、流动相和质谱条件的优化，建立了一种超高效液相色谱-串联质谱快速筛查药用胶塞中12种抗氧剂的分析方法。本方法前处理简单快速，灵敏度高，定性定量准确，为保证药品包装材料的安全使用提供了技术手段。