藏药八味沉香散血清对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用※

马春秀，李彩霞，宫佰会，岳栋芳，李永芳，寇毅英

(青海大学医学院，青海 西宁 810001)

藏药八味沉香散是治疗心血管疾病常用的藏药古方之一，在临床预防缺血性心脏病(冠心病、心绞痛)中效果明显，但其作用机制不明。本研究结合中药血清药理学方法制备八味沉香散血清，通过研究八味沉香散血清对大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中LDH、CK活性的影响，探讨八味沉香散血清对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

清洁级雄性SD大鼠[西安华仁生物科技有限公司，许可证号：SCXK(陕)2018-0001，10～12周龄，体重200～250g]；大鼠H9c2心肌细胞[普诺赛生物科技有限公司]。

1.1.2 药品与试剂

藏药八味沉香散(西藏神猴药业公司，批号：20200601)，复方丹参片(广州白云山和记黄埔公司，批号：J19A024)。DMEM高糖培养基(普诺赛公司，批号：WH0521P121)，DMEM无糖培养基(普诺赛公司，批号：WH01122012XP01)。胎牛血清(普诺赛公司，批号：21020701)，胰蛋白酶(普诺赛公司，批号：WH01122101SP01)，磷酸盐缓冲盐溶液(普诺赛公司，批号：20201219)，青霉素链霉素(索莱宝公司，批号：20201127)，二甲基亚砜(索莱宝公司，批号：710N0310)，四甲基偶氮唑蓝(武汉伊莱瑞特公司，批号：MLQ45K8QFE)。CCK-8试剂盒(武汉伊莱瑞特公司，批号：8R1NBWTULX)，LDH乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成公司，批号：20210618)，CK肌酸激酶试剂盒(上海泛柯公司，批号：202104)。

1.1.3 仪器

超净工作台(苏州安泰公司)，恒温二氧化碳培养箱(上海力康公司)，三气培养箱(上海力康公司)，荧光倒置显微镜(德国徕卡公司)，全波长酶标仪(美国赛默飞公司)，离心机(德国艾本德公司)。

1.2 方法

1.2.1 空白血清和含药血清的制备方法

将60只雄性SD大鼠随机分为空白组，八味沉香散低、中、高剂量组及复方丹参片(阳性药物)组，每组12只。八味沉香散组大鼠每天灌胃[剂量：低(0.5g/kg)、中(1g/kg)、高(2.5g/kg)剂量的八味沉香散]，复方丹参片组每天灌胃(0.6g/kg)，空白组每天灌胃(等容量的蒸馏水)，连续10 d。八味沉香散组在末次给药1.5 h(复方丹参片组在末次给药4h)后麻醉(异氟烷吸入)，经腹主动脉采血，置无菌试管中离心(4000r/min，15min)，取上清液以水浴法(56℃，30min)灭活，最后用滤膜(0.22μm)除菌，置-80 ℃冰箱。空白血清及含药血清在使用前用DMEM培养基稀释。

1.2.2 血清最佳添加量筛选方法

用MTT法筛选血清最佳添加量。收集对数生长期的大鼠H9c2细胞，按5×103/孔的密度接种于96孔板中，常规培养24 h后弃去原培养基，每孔(总体积200μL)加入新鲜培养基，按空白血清添加量分组(0%、10%、20%、30%、40%、50%组)，每组设置6个复孔，用二氧化碳培养箱做常规培养48 h后，加入20 μL的MTT溶液，置二氧化碳培养箱孵育4 h，弃上清液，每孔加100 μL的DMSO孵育(避光，37℃，10min)后检测OD值(490nm)，确定最佳血清添加量。

1.2.3 心肌细胞缺氧/复氧模型的建立方法

将H9c2心肌细胞加入DMEM高糖培养基(10%胎牛血清+1%青链霉素混合液)后置于二氧化碳培养箱(5% CO2，37℃)中培养，次日换液，待细胞汇合率达90%时加适量0.25%胰蛋白酶消化后，按1：3的比例进行传代，取对数生长期细胞实验。改进缺氧/复氧模型制备方法[1，2]：用DMEM高糖培养基常规培养H9c2细胞于二氧化碳培养箱中，待细胞密度至80%时，弃原培养液，加入不含血清的无糖培养基置三气培养箱(37℃，5%CO2，2%O2，93%N2)中8 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞2次，加入DMEM高糖培养基并置二氧化碳培养箱中复氧4 h。

1.2.4 实验分组与处理方法

将H9c2细胞分为空白组，模型组，八味沉香散血清低、中、高剂量组及阳性对照组，常规培养，待细胞密度达80%时进行换液。在空白组(高糖培养基+20%空白血清)，模型组(无糖培养基+20%空白血清)，八味沉香散血清低剂量组(无糖培养基+20%低剂量含药血清)、中剂量组(无糖培养基+20%中剂量含药血清)、高剂量组(无糖培养基+20%高剂量含药血清)，阳性对照组(无糖培养基+20%阳性药含药血清)中，除空白组外，其他各组处理依照“1.2.3”所示方法：置三气培养箱(缺氧)8 h，空白组同时置二氧化碳培养箱常规培养8 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞2次，进行换液[空白组(高糖培养基+20%空白血清)。将模型组(高糖培养基+20%空白血清)和八味沉香散血清低剂量组(高糖培养基+20%低剂量含药血清)、中剂量组(高糖培养基+20%中剂量含药血清)、高剂量组(高糖培养基+20%高剂量含药血清)及阳性对照组(高糖培养基+20%阳性药含药血清)]细胞置二氧化碳培养箱中复氧4 h。

1.2.5 心肌细胞生长及形态变化观察方法

取对数生长期细胞经胰酶消化后计数，接种于培养皿(6cm2)中并分组，待细胞密度至70%～80%时，按“1.2.4”所示方法进行操作，待缺氧/复氧结束后，在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.6 细胞存活率检测方法

用CCK-8法检测各组细胞存活率。取对数生长期细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105/孔，接种至96孔板中，每孔200 μL，置培养箱行常规培养24 h。分组并按体积比加入相对应的含药血清进行缺氧/复氧干预，待干预结束后，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液(避免产生气泡)，将96孔板在培养箱内孵育1.5 h后，用酶标仪检测OD值(450nm)。

1.2.7 细胞上清液中LDH、CK的活性检测方法

按“1.2.6”所示方法进行铺板、培养、干预，干预结束后分别收集缺氧8 h和复氧4 h后的各组细胞上清液，按照试剂盒说明进行操作，分别测定缺氧8 h和复氧4 h时各组的LDH、CK值。

1.2.8 统计学方法

2 结果

2.1 血清最佳添加量

与0%组相比较，空白血清添加量组(10%～50%)细胞活性均明显大于0%组(P<0.05)；随血清添加量增加(10%～30%)，血清对细胞活性的促进作用逐渐增强，且30%组细胞活性最大(P<0.05)；30%～50%时，促进作用逐渐减弱且活性均比20%组低；0%～50%时总体呈先上升后下降的趋势，考虑大于30%的血清可能产生细胞毒性作用而导致细胞活性下降。具体数据详见表1。因此，最佳血清添加量为20%。

表1 大鼠空白血清不同添加比例对H9c2心肌细胞活性的影响值

2.2 八味沉香散血清对各组心肌细胞生长及形态的影响情况

缺氧/复氧结束后，细胞形态如图1所示，A：空白组细胞生长状态良好，呈正常长梭形，细胞膜完整，细胞均匀贴壁生长；B：模型组细胞形态不完整，细胞形态由正常长梭形变为不规则圆形(有明显皱缩)，表面死细胞数增多；与模型组细胞相比，八味沉香散血清各组细胞形态趋于正常，且中剂量组、阳性组细胞形态较为完整。

A：空白组；B：模型组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组；F：阳性对照组

2.3 细胞存活率

CCK-8实验结果显示，与空白组相比，模型组细胞存活率显著降低(P<0.05)；与模型组相比，八味沉香散血清低、中、高各组细胞存活率均有明显升高(P<0.05)，且八味沉香散血清各组中，中剂量组细胞存活率最高。具体数据详见表2。

表2 八味沉香散血清对缺氧/复氧处理心肌细胞存活率的影响值

2.4 八味沉香散血清对各组细胞上清液中LDH、CK的影响情况

缺氧8 h时，与空白组相比，模型组上清液中的LDH、CK活性明显升高(P<0.05)；与模型组相比，八味沉香散血清中剂量组LDH显著降低(P<0.05)，八味沉香散血清低、中、高剂量组CK均明显降低(P<0.05)。复氧4 h时，与空白组相比，模型组上清液中的LDH、CK活性明显升高(P<0.05)；与模型组相比，八味沉香散血清中、高剂量组LDH、CK显著降低(P<0.05)。具体数据详见表3。

表3 八味沉香散血清对心肌细胞缺氧/复氧后LDH、CK的影响值

3 讨论

截至目前，治疗心肌缺血的一种重要策略是缺血再灌注，但再灌注治疗会致心肌损伤，称为“再灌注损伤”[3，4]。

血清药理学是一种在复方药效学研究领域新兴的药理实验方法，是指将中药及复方制剂经灌胃给药，经过动物体内吸收和机体的生物转化后收集其血清的方法[5]。其独特优势体现在经动物给药后因经过了机体进一步代谢，更好地模拟了中药(复方)最终入血的有效成分[6，7]。而含药血清的添加量是血清药理学体外实验中不可忽视的问题之一。有学者报道，含药血清在高浓度可抑制细胞的增殖[8]，10%含药血清浓度最宜在体外实验时选取；另有学者研究发现含药血清的添加量不宜超过20%[9]；也有研究发现种属关系相近或者同种属的较高浓度血清具有促进细胞增殖的作用，种属较远的血清在低浓度时(10%～40%)才能促进细胞增殖[10]。还有学者认为，为避免高浓度血清的毒性作用及考虑实验中被培养细胞对血清的耐受性，实际操作时，可根据预实验选取最佳的血清添加量[11]。本实验结果表明，选取体积分数为20%的血清较适宜，与上述研究结果相符。

对藏药八味沉香散的前期研究发现，其对异丙肾上腺素所致的大鼠心肌缺血损伤具有保护作用[12，13]，对在体的大鼠心肌缺血/再灌注损伤也有很好的保护作用[14]。对八味沉香散单味药有效成分的研究结果显示，八味沉香散所含主要化学成分有黄酮类、酚酸类、脂肪酸类和萜类等，其中的大多数成分具有抗氧化和抗炎作用[15，16]，与其具有治疗缺血性心脏病的功效相符。

本研究以血清药理学方法并采用离体心肌细胞模型(模拟心肌缺血损伤、复氧再灌注损伤)，对LDH、CK进行研究。研究结果显示，八味沉香散血清不仅对心肌缺血损伤具有保护作用，而且对再灌注损伤也具有一定的保护作用。同时，实验结果显示缺氧/复氧(12h)结束后，八味沉香散血清各组细胞形态趋于正常，细胞存活率均有升高，且八味沉香散中剂量含药血清细胞存活率最高，进一步证实了八味沉香散血清具有抗缺氧/复氧损伤的作用。

综上所述，藏药八味沉香散血清对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤具有一定的保护作用。