丙二醇、氮酮、薄荷醇对黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱体外透皮吸收的影响※

王 倩，喇林立，刘贵琴，白 雪，杨建鑫，段雅彬，朱俊博，周 杨，顾文琦，李向阳，3*

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001；3.三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016)

如何提高黄香愈肤乳膏的透皮吸收率是实现药物设计目的的关键环节，也是目前膏剂类产品品质控制的难点。本研究在前期研究的基础上，在乳膏剂中加入丙二醇、氮酮及薄荷醇等促渗剂，考察累积渗透量和稳态透皮速率及取样末点盐酸小檗碱的皮肤滞留量，以此综合判断丙二醇、氮酮、薄荷醇对黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱体外透皮吸收的影响。本研究通过对黄香愈肤乳膏体外渗透特性的研究，为最佳透皮剂筛选提供了依据，同时也为该制剂的安全性评价提供了参照，为后续研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

薄荷醇(批号：D813157，99%)、1，2-丙二醇(批号：P815581，分析纯)、氮酮(批号：A800359，97%)、盐酸小檗碱标准品(批号：C10835997)均购自上海麦克林生化科技有限公司，乙醇(批号：20201128，分析纯)购自天津市博华通化工产品销售中心，生理盐水(批号：H37020764，0.9%)购自山东齐都药业有限公司。

1.1.2 仪器

BT25S电子天平购自德国赛多利斯科学仪器公司，TGL-16B离心机购自上海安亭科学仪器厂，XHF-DY高速分散器购自宁波新芝生物科技股份有限公司，HK-300CDE型超声波清洗器购自杭州市汇尔仪器设备有限公司，LC-2030 Plus高效液相色谱仪购自岛津马来西亚工厂，YB-P6智能透皮实验仪购自天津药典标准仪器制造厂。

1.1.3 实验动物

SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200±20 g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，合格证编号：SCXK(陕)2018-001。

1.2 方法

1.2.1 盐酸小檗碱含量测定

1.2.1.1 色谱条件选择

XDB-C18色谱柱(3.0×250.0mm，5μm)，流动相为乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液(0.1%磷酸，35：65)，体积流量0.5 mL/min，检测波长345 nm，柱温30 ℃，进样量为40 μL。

1.2.1.2 对照品溶液制备

精密称取盐酸小檗碱对照品5.02 mg置于5 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，即得浓度为1000 μg/mL盐酸小檗碱对照品溶液，按比例稀释成浓度为10.000、5.000、1.000、0.500、0.100、0.010、0.002 μg/mL的盐酸小檗碱对照品工作液。

1.2.1.3 供试品溶液制备

取透皮实验中获得的接收液离心(12000r/min，5min)取上清液，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，即得供试品溶液。

1.2.1.4 标准曲线绘制

精密量取“1.2.1.2”项下制备的盐酸小檗碱对照品工作液，进样分析，记录峰面积，以盐酸小檗碱浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程：y=341005x-2997.2，R2=1，结果显示在0.002～10.000 μg/mL范围内，盐酸小檗碱质量浓度与峰面积之间线性关系良好。

1.2.1.5 专属性考察

精密量取空白皮肤接收液、供试品溶液、对照品溶液做进样分析，实验结果显示皮肤接收液中的内源性物质对供试品溶液中盐酸小檗碱的含量测定无干扰作用，表明此方法专属性良好。接收液的HPLC图见图1。

1.2.1.6 精密度实验

精密量取10.00、1.00、0.01 μg/mL盐酸小檗碱对照品溶液，于1 d内重复进样6次，3 d内每天重复进样2次(每12h 1次)，测定各成分的峰面积，结果显示高、中、低浓度的盐酸小檗碱对照品溶液日内精密度RSD分别为1.15%、0.08%、0.01%，日间精密度RSD分别为1.62%、0.94%、1.85%，表明仪器的精密度良好。

1.2.1.7 重复性实验

按“1.2.1.3”项下供试品溶液的制备方法，取同一时间点的6份样品测定峰面积，考察方法的重复性，结果显示试品溶液峰面积的RSD为2.75%，表明方法的重复性良好。

1.2.1.8 稳定性实验

精密量取“1.2.1.3”项下制备的供试品溶液适量，于制备后0、2、4、6、8、12、24 h做进样分析，结果显示供试品溶液浓度的RSD为2.16%，表明供试品溶液在0～24 h内稳定。

1.2.1.9 加样回收率实验

在已知量的低、中、高3个浓度的样品透过液中加入等体积浓度为1、5、10 μg/mL的盐酸小檗碱标准品溶液，每个浓度制备3份样品做进样分析，实验结果显示，1、5、10 μg/mL的盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为100.81%、96.10%和95.29%，RSD分别为0.83%、0.51%和0.15%，符合规定。加样回收率实验结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

1.2.1.10 供试品溶液测定

取“1.2.1.3”项下的供试品溶液，按上述色谱条件做进样分析，测定各样品峰面积并计算浓度。

1.2.2 体外透皮实验

1.2.2.1 离体鼠皮的制备

用异弗烷麻醉大鼠后，以生理盐水湿润大鼠背部毛发，用手术刀片将其剔除干净，12 h后脱颈处死，剥离背部皮肤，剔除皮下脂肪组织和血管，用生理盐水冲洗干净后平铺于铝箔上置-20 ℃冰箱冻存。实验前将皮肤自然解冻，检视皮肤是否完整。

1.2.2.2 促渗剂的初步选择

选择浓度为1%、2%、3%、5%的丙二醇、氮酮及薄荷醇作为单一促渗剂，选择各浓度促渗剂两两联用作为复合促渗剂，分别加入乳膏中，选择对乳膏性状及稳定性无影响的促渗剂做进一步研究。

1.2.2.3 体外透皮实验

将制备好的离体皮肤自然固定在Franz扩散池(有效透皮面积为2.01cm2，接收液体积为17mL)上，角质层面朝供给室。精密称取乳膏剂1.0 g均匀涂布于大鼠角质层上，用一层塑料薄膜覆盖。以20%乙醇-生理盐水溶液为接收液，将接收液超声30 min后加入接收池(水浴温度为37℃±2℃，磁力搅拌转速为300r/min)平衡1 h，排除气泡。于给药前及给药0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h时从接收室取样1.0 mL，每次取样后立即补足等体积的新鲜接收液，用HPLC仪检测接收液中盐酸小檗碱浓度，按如下公式计算体外经皮渗透参数：

其中，Qn表示各成分在单位面积上的累积透过量(μg·cm-2)；Cn表示第n个取样点测得的接收液中药物的浓度(μg·mL-1)；Ci表示第i(i=n-1)个取样点测得的接收液中的药物浓度(μg·mL-1)。

以Qn对取样时间t作图，绘制含有不同促渗剂的黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱的累计渗透曲线。以Qn对t作线性回归，所得方程即渗透动力学方程，直线的斜率即为稳态透皮速率Js(μg·cm-2·h-1)。使用OriginPro 8.0软件对盐酸小檗碱累计透皮量进行零级动力学模型、一级动力学模型与Higuchi模型拟合。

于结束时取下鼠皮，分离皮肤层和乳膏层，剪去多余的皮肤，剩下与乳膏接触的皮肤备用。将取下的皮肤剪碎、研磨至乳糜状，加入2 mL甲醇，超声振荡，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，注入HPLC仪测定峰面积，计算皮肤滞留量。

1.2.3 统计学分析

2 结果

2.1 促渗剂的初步筛选

促渗剂初步筛选结果表明以2%丙二醇、2%薄荷醇、2%氮酮、2%丙二醇+2%薄荷醇、2%丙二醇+2%氮酮作为促渗剂时，乳膏的外观性状及离心稳定性均无明显变化，因此选择上述促渗剂进行进一步体外透皮实验研究。

2.2 体外透皮实验

体外透皮实验结果显示，不同促渗剂对黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱的体外透皮吸收性能产生不同影响，且差异较大，与不含促渗剂组相比，2%丙二醇组第12 h的盐酸小檗碱累计渗透量显著升高了92.92%(P<0.05)，2%薄荷醇组、2%丙二醇+2%薄荷醇组有一定的升高，但无统计学意义，2%氮酮组显著降低了78.86%(P<0.05)，2%氮酮+2%丙二醇组有降低趋势，但无统计学意义。不同促渗剂的黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱的累计渗透曲线见图2，第12 h盐酸小檗碱的累计渗透量见表2。

图2 含不同促渗剂黄香愈肤乳膏累计渗透曲线

表2 含不同促渗剂黄香愈肤乳膏经皮渗透参数

与不含促渗剂组相比，2%丙二醇组的盐酸小檗碱的稳态透皮速率显著升高了86.67%(P<0.05)；2%薄荷醇组和2%薄荷醇+2%丙二醇组有升高趋势，但无统计学意义；2%氮酮和2%氮酮+2%丙二醇组有降低的趋势，但无统计学意义。综合考虑，2%丙二醇为最佳促渗剂。稳态透皮速率结果见表2。

与不含促渗剂组相比，除2%丙二醇组的盐酸小檗碱的皮肤滞留量变化无统计学意义(P>0.05)外，其余各组均有统计学意义(P<0.05)。盐酸小檗碱皮肤滞留量见表2。

分别采用零级动力学模型、一级动力学模型与Higuchi模型对黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱的体外透皮吸收曲线进行回归分析，结果显示，相比于零级动力学模型和Higuchi模型，各组一级动力学模型的R2均较高，说明无论使用何种透皮剂，黄香愈肤乳膏中盐酸小檗碱的浓度变化规律都更符合一级动力学模型。拟合方程结果见表3。

表3 含不同促渗剂黄香愈肤乳膏透皮吸收动力学方程

3 讨论

体外透皮实验是测定外用制剂经皮扩散特性最常用的方法。大鼠皮肤的组织结构与人体皮肤基本一致[1，2]，因此本实验选择大鼠背部皮肤考察黄香愈肤乳膏的经皮渗透特性。

体外透皮实验中接收液模拟了皮肤下的体液，体外实验要求接收液不能与药物发生反应，同时符合漏槽条件[3]，一般以生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等作为接收液，为增大脂溶性药物的溶解度，通常会加入一定比例的有机溶剂，本实验在前期研究中分别在生理盐水及PBS中加入了10%、20%、30%的无水乙醇，测定中药提取浸膏在上述接收液中饱和时盐酸小檗碱的含量，结果发现生理盐水中测得的盐酸小檗碱含量高于PBS中测得的盐酸小檗碱含量，且乙醇含量越多，盐酸小檗碱含量越高。有研究指出，当乙醇含量超过20%时，皮肤褶皱展开，毛囊口扩张，皮肤正常生理结构发生改变[4]。因此本实验最终以20%的乙醇-生理盐水作为接收液。

在研究中药复方外用制剂时，为提高其有效成分的透皮量，通常会在其中加入一定比例的透皮剂，目前常用的透皮剂种类包括亚砜类(如DMSO)、脂肪酸酯类(如IPM、PGML)、氨基化合物类(如氮酮)、有机醇类(如丙二醇)等，这类透皮剂通过改变角质层的结构或者增加促渗剂与角质层的作用来增强药物在皮肤中的渗透能力[5，6]。其中，氮酮、丙二醇、薄荷醇为最常用的促渗剂，其不仅有较好的促透作用，且毒性小、化学性质稳定[7-9]，因此本实验选择上述三种单一促渗剂及两两联用的复合促渗剂开展体外透皮性能研究。研究结果发现，以丙二醇作为促渗剂时，透皮效果较好，相较于不含促渗剂组，其累计渗透量及稳态透皮速率均显著升高，故最终选择2%的丙二醇作为黄香愈肤乳膏的促渗剂。研究发现丙二醇组的皮肤滞留量与不含促渗剂组相比无明显变化，而其他各组均显著降低，其原因可能与各促渗剂的不同促渗机制相关，丙二醇通过作用于细胞内途径提高药物的透过量，而薄荷醇和氮酮属于油性介质，主要是通过增加药物在脂质分子层中的溶解增加药物的渗入量[10-12]，由此造成不同组皮肤滞留量及累计渗透量之间的差异。

本研究对促渗剂的考察发现氮酮作为促渗剂时，无论单独使用还是与丙二醇联合使用，促渗效果均不理想，有研究指出，氮酮对log Ko/w值约为-0.5的药物具有较好的促透作用[13]，而盐酸小檗碱log Ko/w=3.45，由此导致氮酮对盐酸小檗碱的促透效果不佳。此外，许多研究都发现氮酮对药物的促透作用并非与氮酮添加量成正比[14，15]，本研究中以不影响乳膏性状的最大浓度氮酮作为透皮剂，故本研究中盐酸小檗碱的透过量低也可能是因为所选择的氮酮浓度不合适，未达到最佳促渗效果。也有研究发现以氮酮作为软膏剂的促渗剂时透皮效果差，指出是由于氮酮的加入导致软膏剂粒径增大，从而阻碍了药物的透皮吸收[16]，但本实验中是否存在该问题还需要进一步研究。

研究发现，盐酸小檗碱可降低人皮肤成纤维细胞中紫外线诱导的MMP-1表达，增加Ⅰ型胶原蛋白的表达，还可以预防皮肤炎症和细胞外基质蛋白的降解[17，18]。由此认为，盐酸小檗碱是黄香愈肤乳膏中抗紫外线损伤的主要成分。此外，本研究在做线性关系考察时发现，盐酸小檗碱具有很强的紫外线吸收能力，以HPLC仪检测时，其检测限可至0.002 μg/mL，透皮实验0～4 h为透皮吸收的平缓期，此时接收液中盐酸小檗碱的浓度较低，而基于盐酸小檗碱化学性质稳定、检测灵敏度高的特点，采用HPLC法即可检测接收液中的盐酸小檗碱，故本实验采用盐酸小檗碱值作为透皮吸收的检测指标是可行的。