益气活血通络方对糖尿病肾病大鼠肾组织RAGE/NOX4/ROS信号通路及氧化应激的影响

强家维， 靳贺超， 梁胜然， 张冠文， 吕哲， 郭登洲,*

(1.河北中医学院 研究生学院， 河北 石家庄 050000； 2.河北中医学院 第一附属医院 肾二科， 河北 石家庄 050000)

根据国际糖尿病联合会糖尿病地图集第9版[1]的数据，全世界已有近10亿人罹患糖尿病，预计到2030年患者人数占比将增加25%，到2045年，预计将增加51%。作为糖尿病患者最严重的微血管并发症之一，糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)的发病率也在逐年上升。DKD的病理特征是肾小球系膜细胞扩张、基底膜增厚、细胞外基质积聚，继而出现肾小球硬化和肾功能下降,严重威胁人体的代谢功能和身体健康。该病生理病理机制复杂，已成为我国导致终末期肾病最重要的单一因素[2]。影响DKD进展的因素众多，如高血糖、氧化应激、脂代谢紊乱和晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)等都会推动DKD的发生及发展。其中，高糖下的氧化应激是导致DKD进展的关键因素，过度的氧化应激会促进DKD的发展[3]。本课题组前期研究发现，由当归、黄芪组成的当归补血汤可通过改善线粒体功能障碍减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生[4]。有研究表明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)同样是ROS的重要来源[5]，晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)/NOX4通路[6]能够对ROS产生影响，干预氧化应激状态，存在减轻DKD大鼠肾损伤的可能机制。

本课题组以中医相关理论为基础并结合多年临床实践，认为瘀血阻络证是贯穿DKD病程的重要病机[4]。采用益气活血、化瘀通络的治法是治疗DKD的关键所在，益气活血通络方由益气活血经典名方当归补血汤化裁而来，选用中药黄芪、当归、丹参、地龙。本课题组前期研究发现，使用益气活血中药治疗DKD模型大鼠的疗效明显[7]，相关实验证实益气活血通络方可降低DKD大鼠肾组织中ROS的表达，缓解氧化应激，起到明显的肾脏保护及延缓病程进展作用[8]。在前期研究基础上，本研究通过观察益气活血通络方对DKD大鼠肾组织病理、RAGE/NOX4/ROS通路在肾组织中表达的影响，探究该方通过调控RAGE/NOX4/ROS信号通路而减轻DKD大鼠氧化应激的可能性。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器

1.1.1 动物

选取清洁级 SD 大鼠(雄性)40只，日龄：42～48 d，体质量：(200±20)g。实验大鼠由北京维通利华公司提供，实验动物生产及使用许可证号：SCXK(京)2016-0006，质量合格证号：110011200106395282。动物饲养环境条件为温度22～25 ℃，湿度50%～70%。河北中医学院动物伦理委员会批准编号：DWLL2019018。普通饲料及高脂高糖饲料均由南京盛民科研动物中心提供，编号HD001。造模组大鼠通过为期6周的高糖高脂饲料饲养，联合腹腔注射链脲佐菌素35 mg·kg-1建立DKD大鼠模型，干预20周后禁食不禁水12 h，使用戊巴比妥钠45 mg·kg-1麻醉，股动脉取血，采集标本。

1.1.2 药物与试剂

每付益气活血通络方免煎颗粒由当归3 g(批号0071093)、黄芪6 g(批号0061513)、丹参1.8 g(批号0070253)、地龙1 g(批号0057073)组成，广东一方制药有限公司配制。厄贝沙坦分散片，浙江华海药业(75 mg/片，批号H20030016)；链脲佐菌素(streptozocin,STZ,批号S0130)购自美国sigma公司；微量白蛋白(microalbumin,mALB)试剂盒(批号E038-1-1)，锰超氧化物歧化酶(supseroxide dismutase 2, SOD2)试剂盒(批号A001-2-1)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒(批号A003-2-2)均购自南京建成生物工程研究所；DAPI染液(批号GDP1012)，HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(批号GB23303)，ROS染液(批号GDP1018)均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；兔来源一抗 RAGE(批号ET1702-27)、NOX4(批号ET1607-4)、SOD2(批号ET1701-54)均购自杭州华安生物技术有限公司；β-激动蛋白(β-actin)抗体(批号AC026)，购自武汉ABclonal公司。

1.1.3 仪器

病理切片机(RM2016)产自德国Leica公司；ONETOUCH型血糖仪产自美国强生LifeScan公司；光学显微镜(BX53)产自日本Olympus公司；荧光显微镜(BX43)产自日本Olympus公司；高速冷冻离心机(1-15K)产自美国sigma公司；半干转膜仪(Semi-Day)产自美国Bio-Rad公司；电泳仪(DYCZ-40K)产自北京六一仪器厂；酶标仪(Infinite 200)产自瑞士Tecan公司； Clinx ChemiScope荧光及化学发光成像系统产自上海Clinx公司。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制备、分组及给药

普通饲料适应性喂养40只SD大鼠，7 d后检测尿蛋白及血糖，结果均为阴性。按随机数字表法选取正常对照组(CON)大鼠7只，予普通类型饲料喂养；供给其余大鼠高糖高脂饲料，为期6周，之后保证12 h内禁食不禁水，将STZ溶于柠檬酸钠缓冲液中配制成浓度为0.1 mmol·L-1的溶液，每kg大鼠体质量注射35 mg溶液，将溶液一次性注射进大鼠腹腔，同时等量柠檬酸钠缓冲液注射给CON组大鼠。72 h后大鼠尾静脉取血查随机血糖，1次/d，3次浓度均大于等于16.7 mmol·L-1时，为成功制备Ⅱ型糖尿病模型[9]。2只大鼠血糖低于标准予以剔除，2只大鼠腹腔注射STZ溶液72 h内死亡。将29只Ⅱ型糖尿病模型大鼠随机分为模型组(MOD)8只、益气活血通络方低剂量组(DL)7只、益气活血通络方高剂量组(DH)7只、厄贝沙坦组(IRB)7只。药物灌胃量按照人与大鼠药物剂量折算公式[10]计算，益气活血通络方低剂量组为每kg大鼠体质量灌胃1.09 g药物溶液，益气活血通络方高剂量组为每kg大鼠体质量灌胃2.18 g药物溶液，厄贝沙坦组为每kg大鼠体质量灌胃0.017 g厄贝沙坦，给药组大鼠灌胃给药，频率为1次/d，其余两组大鼠用等量生理盐水灌胃，给药周期为20周，20周内每周检测体质量，每4周检测一次尿微量白蛋白(U-mALB)。

1.2.2 全自动生化分析仪分析UACR值、TBA法检测血清MDA浓度及羟胺法检测SOD2活性

给药结束后，收集大鼠随机尿，全自动生化分析仪检测U-mALB含量及尿肌酐含量，计算其比值即为UACR值，该指标对于诊断早期肾损伤具有重要意义。大鼠麻醉后，股动脉取血，离心机分离上清取样，采用TBA法检测MDA浓度，羟胺法检测SOD2活性。

1.2.3 HE染色法、Masson染色法、PAS染色观察各组大鼠肾组织病理形态变化

大鼠麻醉取出肾脏后，左肾沿纵轴切开，取肾皮质用4%多聚甲醛固定48 h，脱水透明后石蜡包埋、切片，分别进行HE染色、Masson染色、PAS染色，通过光学显微镜观察肾组织病理变化，并采集图像。

1.2.4 荧光探针标记法检测大鼠肾组织ROS表达水平

在大鼠肾组织常规制备成的石蜡切片上滴加ROS染液，在室温下避光浸入10 μmol/L二氢乙锭(dihydroethidium，DHE)溶液孵育30 min，滴加DAPI染色液以染核，PBS液洗涤3次后，滴加适量抗荧光淬灭剂后封片，在荧光显微镜下观察肾组织中红色荧光情况，其荧光强度可反映ROS在不同组大鼠中表达量的变化。通过Image-Pro Plus 6.0 软件对所得图片进行半定量分析，检测结果为IOD值与面积的比值。

1.2.5 IHC法检测大鼠肾组织RAGE、NOX4蛋白表达水平

取大鼠肾组织石蜡切片，在放入3%双氧水溶液前先进行抗原修复，加入血清封闭， 滴加PBS稀释好的RAGE一抗(VRAGE∶VPBS=1∶200)、NOX4一抗(VNOX4∶VPBS=1∶200)，4 ℃孵育过夜后，加入HRP标记的二抗， DBA显色，并复染，然后封片，在显微镜下观察并拍照。用Image-Pro Plus 6.0 软件分析免疫组化图片。

1.2.6 Real-time PCR法检测大鼠肾组织NOX4mRNA表达水平

研磨适量肾组织，遵照试剂盒说明书操作提取总RNA，检测RNA浓度及纯度，使用一步法完成逆转录，引物由中实(天津)检验检测有限公司合成，引物序列NOX4上游引物5’-CATCGATCTCTCTCGTGGGC-3’，下游引物5’-CGTACACGTAGTCCCACTCG-3’，长度234 bp；β-actin上游引物5’-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3’，下游引物5’-AGGGTCAGGATGCCTCTCTT-3’，长度为262 bp。据说明书完成引物扩增。反应条件为95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃ 退火20 s，循环40次。以β-actin为内参，2-ΔΔCT法计算出结果，即目的基因表达的相对量。

1.2.7 Western blot法检测大鼠肾组织SOD2、RAGE、NOX4蛋白表达水平

取适量各组大鼠肾组织，每20 mg肾组织加入150 μL RIPA裂解液，经过匀浆、裂解后，离心机离心取上清液，据BCA试剂盒内置说明书测定蛋白浓度。蛋白样品经10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，再通过转膜液进行PDVF膜转膜，置入装有脱脂牛奶的孵育盒常温封闭，使用适当浓度的一抗SOD2(VSOD2∶V抗体稀释液=1∶1 000)、RAGE(VRAGE∶V抗体稀释液=1∶1 000)、NOX4(VNOX4∶V抗体稀释液=1∶1 000)、β-actin(Vβ-actin∶V抗体稀释液=1∶1 000)孵育过夜，回收一抗并以每次5 min时长为准用TBST洗3次，加入二抗(V二抗∶V抗体稀释液=1∶5 000)，室温孵育30 min，加入ECL试剂显影。利用Image J软件定量分析相应条带灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠的一般特征

CON组大鼠精神状态良好，毛色光泽顺滑，行动敏捷，日摄食量、饮水量、排尿量及活动量均正常，体质量增长符合周龄。MOD组大鼠表现精神状态欠佳，皮毛发黄发暗并见脱毛现象，部分大鼠眼球浑浊，行动迟缓，活动量减少，日摄食量、饮水量及尿量均出现明显增多，并伴有消瘦、体质量减轻。与MOD组比较，各治疗组大鼠均有不同程度地好转，提示益气活血通络方及厄贝沙坦对DKD大鼠临床症状有改善作用。

2.2 对DKD大鼠UACR、SOD2、MDA的影响

与CON组比较，MOD组大鼠UACR值、MDA浓度均显著升高， SOD2活性显著降低(P<0.01)；与MOD组比较，IRB组及DH组SOD2活性明显升高，UACR值、MDA浓度明显降低(P<0.05，P<0.01)；DL组差异无统计学意义。见图1。

1)P<0.05；2)P<0.01

2.3 对DKD大鼠肾组织病理学影响

与CON组比较，MOD组大鼠有以下病理表现：HE染色显示肾小管基底膜增厚，Masson染色显示肾小球肥大，系膜基质增多明显，系膜增生明显，PAS染色显示肾小球基底膜增厚，系膜基质显著增多，有K-W结节；与MOD组比较，除CON组大鼠外其余各组肾组织病理及均有不同程度改善，其中DH组改善程度最明显，优于DL组、IRB组，DL组改善程度最差。见图2-4。

图2 各组DKD大鼠肾组织的HE染色结果(×400)

图3 各组DKD大鼠肾组织的MASSON染色结果(×400)

2.4 对DKD大鼠肾组织ROS表达的影响

如图5，与CON组比较，MOD组大鼠肾组织中红色荧光表达明显增多(P<0.01)，提示肾组织中ROS表达明显增多，氧化应激程度最明显；与MOD组比较，DL组、DH组、IRB组ROS表达均有不同程度减少，其中DH组减少有统计学意义(P<0.05)。

2.5 对DKD大鼠肾组织NOX4、RAGE蛋白定位表达的影响

与CON组比较，MOD组大鼠肾组织RAGE、NOX4蛋白表达显著升高(P<0.01)；与MOD组比较， DL组、DH组、IRB组大鼠RAGE、NOX4蛋白表达明显降低(P<0.05，P<0.01)。见图6。

1)P<0.05; 2)P<0.01

2.6 对DKD大鼠肾组织NOX4 mRNA表达的影响

与CON组比较，MOD组大鼠肾组织NOX4mRNA表达显著升高(P<0.01)；与MOD组比较，IRB组大鼠及DH组NOX4mRNA表达均有降低(P<0.05)，DL组与MOD组的差异无统计学意义。见图7。

1)P<0.05; 2)P<0.01

2.7 对DKD大鼠肾组织SOD2、RAGE、NOX4蛋白表达的影响

与CON组比较，MOD组大鼠肾组织RAGE、NOX4蛋白表达显著升高，SOD2水平显著降低(P<0.01)；与MOD组比较，各给药组SOD2蛋白表达明显升高，IRB组及DH组大鼠RAGE，NOX4表达明显降低(P<0.05，P<0.01)。见图8。

图8 各组DKD大鼠肾组织中SOD2、RAGE、NOX4蛋白表达

3 讨论

目前对于DKD的治疗手段相对局限，现代医学主要治疗方法为降血糖和降血压，但这难以改变DKD发展为终末期肾病乃至死亡的结局，DKD以及其他并发症的发病率和死亡率仍然很高[11]，大多数患者会进展为终末期肾病，需要终生透析或肾移植[12]。在DKD诸多病理机制中，氧化应激近年来获得学术界越来越多的关注，同时它也是促进DKD发生发展的不容忽视的推动剂。中国传统中医药治疗DKD的相关研究不断涌现，为该病的治疗提供了新思路，相关成果显示中医药在DKD防治方面有独特优势[13-14]。

糖尿病肾病属中医文献中记载的“肾消”及其消渴病继发的“水肿”“尿浊”等范畴。《圣济总录》曰: “消肾，小便白浊如凝脂，形体羸瘦。”《杂病源流犀烛》中指出“有消渴后身肿者，有消渴面目膝肿小便少者。” 本病早期中医病机是阴虚燥热，日久阴伤气耗，导致气阴两虚，继而阴损及阳，进展至阴阳两虚，最终发展到气血阴阳俱虚这一证候；因本病多迁延难愈，久病多虚，气无血不载，血无气不行，气虚则无力推动血行以成瘀血，瘀血阻络证贯穿DKD病程始终。因此益气活血、化瘀通络是治疗DKD的关键。益气活血通络方中黄芪补气固表为君，且黄芪3倍于当归，意在补气，且能生血、行血，当归补血活血为臣，二药主以益气活血；方中又佐丹参活血祛瘀，地龙通经活络，全方共奏益气活血、化瘀通络之功效。其中黄芪中所含有效成分黄芪甲苷等，在抗氧化应激、抑制足细胞凋亡、延缓DKD发展方面作用突出[15-16]；当归中阿魏酸等有效成分，药理作用有抗氧化，保护肾组织[17]。本课题组前期研究证实当归、黄芪配伍可通过抗氧化应激、减少24 h尿蛋白、抑制系膜细胞增殖等作用改善 DKD症状[4，7]。吴芳等[18]通过网络药理学分析发现，丹参可通过减轻氧化应激反应等过程保护肾小球、减轻肾损伤。关于地龙的药理研究发现，地龙抗氧化提取物在体外具有较强的清除ROS的作用，可以升高成年小鼠血液中SOD活性且降低MDA浓度，降低小鼠体内的脂质过氧化水平并且防止体内抗氧化酶受ROS诱导的氧化应激损伤[19]。本研究结果显示造模组大鼠尿蛋白升高，肾小球肥大，系膜增生，基底膜增厚，可见K-W结节，肾小管上皮细胞泡沫样变，符合DKD大鼠模型标准，造模成功。DH组和IRB组分别经益气活血通络方和厄贝沙坦干预后，蛋白尿及肾组织病理明显改善，其中DH组略优于IRB组，提示益气活血通络方和厄贝沙坦对DKD大鼠具有肾保护作用，益气活血通络方高剂量疗效略好于厄贝沙坦。 DL组与MOD组比较，UACR值差异无统计学意义，说明该方在治疗DKD过程中剂量同样是影响疗效的重要因素。

在DKD的起始因素高血糖的诱导下[20]，AGEs和RAGE的生成增加，RAGE作为AGEs关键结合蛋白之一[21]，在肾脏中广泛存在，在肾小球系膜细胞、足细胞、肾小管上皮细胞中均有表达[22]，其在AGEs介导的信号转导以及激活ROS相关因子中具有重要作用[24]。AGEs-RAGE的过度活动能够直接推动DKD的发生发展进程[23]。连接AGEs/RAGE轴及其下游的转运体是NADPH氧化酶中的NOX酶，AGEs/RAGE相互作用可以激活NADPH氧化酶，使其活性显著升高[25]。NADPH酶途径是产生ROS的主要途径之一，NADPH氧化酶有7种亚型，NOX1-5和双氧化酶(DUOX)1和2，NOX酶的生物学功能是通过在生物膜上传递电子来产生ROS，其中，NOX4是DKD肾组织中促进ROS生成增多的关键氧化酶，是肾脏中产生ROS的来源之一[26]，同时NOX4处于肾组织细胞RAGE下游的一条核心通路，与氧化应激密切相关[27]，经由该通路激活下游通路并介导的损伤是DKD的关键病机。相关研究已经证明，抑制NOX4对啮齿类动物的肾脏损伤和糖尿病肾病有保护作用[28-29],基于DKD患者NOX活性增加和ROS生成增多的证据，NOX4等已被探索为潜在的治疗靶点。研究发现，双特异性NOX1/NOX4抑制剂GKT137831可成功地改善糖尿病小鼠模型的肾小球结构改变、蛋白尿和纤维化信号[30-31]。在肾小球系膜细胞对血管紧张素Ⅱ的反应中，NOX4的上调被证明与肥大和纤维连接蛋白的堆积有关[32]，并且NOX4参与介导了高糖反应中足细胞ROS生成增多的过程[33]。NOX4衍生的ROS是糖尿病肾病肾脏形态改变和功能异常的主要因素。许多糖尿病动物模型证明ROS是糖尿病肾病的重要决定因素[34-35]。正常机体会产生少量ROS，其具有保护细胞并维持细胞内环境稳定的作用，但在高糖或AGEs、RAGE等诱导下NOX4氧化酶被激活，会导致肾脏ROS生成增多，机体自身的抗氧化酶等构成的抗氧化防御系统难以负荷，增多的ROS会导致包括蛋白质和DNA在内的细胞成分受到损伤，系膜细胞、足细胞和肾小管细胞发生纤维化反应[36]，最终引起肾小球纤维化和肾功能下降，而导致DKD的进展[37]。综上，高糖诱导下 AGEs与系膜细胞和近端小管上皮细胞中的RAGE结合，激活该条通路，在NOX4作用下引起ROS增多，ROS 在细胞内大量积累，加重氧化应激，导致肾组织损害[38]。本研究中，益气活血通络方降低了肾组织中RAGE、NOX4的表达，明显减少了肾组织中ROS的表达，提示益气活血通络方可能通过RAGE/NOX4/ROS通路减轻了肾组织的损害。本研究为益气活血通络方治疗糖尿病肾病提供了理论依据，中医药治疗疾病特点为多渠道、多靶点，该复方中有效成分是否通过其他途径减轻DKD肾损害有待进一步研究。

综上，益气活血通络方可能通过降低RAGE、NOX4的表达，减少肾组织中ROS的表达，缓解氧化应激，降低高糖条件下DKD大鼠的尿蛋白和肾组织损害，起到明显的防治肾脏损害的作用。

作者贡献声明

强家维：提出研究思路和框架，设计实验、统计分析数据，参与动物实验的具体实施，撰写论文，修改论文；靳贺超：提出研究思路和框架，设计实验、统计分析数据；郭登洲：提供研究方向建议，提供论文修改建议；梁胜然、张冠文、吕哲：参与动物实验的具体实施。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。