气相色谱法测定保健食品中肌醇含量的方法研究

刘文博

（山西省检验检测中心 药品检验技术研究所，山西太原 030031）

肌醇是微生物及动物生长的必要元素，可以从动物的心肌和肝脏中分离取得，主要以磷脂的形式存在，又称肌醇磷脂[1]。肌醇可以代谢清除肝脏脂肪和胆固醇，预防动脉硬化，并且供给脑细胞营养，促进正常发丝的生长[2]。由于肌醇的食物营养强化作用，多应用于运动功能饮品、婴幼儿配方食物等保健食品中，此外在发酵和食品工业中，肌醇可用于多种菌种的培养和促进酵母的增长等作用[3]。目前，肌醇的检测范围主要包括保健食品如功能性饮料及婴儿配方奶粉等，检测方法主要有微生物法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和毛细管电泳法等，各种检测方法有各自的特点与不适用性[4]。本研究结合实验室现有设备条件，对GB 5009.196—2003[5]中气相色谱法测定保健食品中的肌醇含量进行方法学验证，并探讨了前处理过程中的关键点，旨在为今后相关部门开发出更为准确精密、检测范围更广的实验方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乐虎功能性保健饮料（达利食品集团有限公司）；国家药品标准物质肌醇（纯度为99.6%，中国食品药品检定研究院）；无水乙醇、正己烷、六甲基二硅氨烷、N,N-二甲基甲酰胺（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司）；三甲基氯硅烷（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为一级超纯水。

1.2 仪器与设备

GC-2010 气相色谱仪（附氢火焰检测器，日本岛津公司）；XS 105 微量天平（精度0.000 01g，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；EV311 旋转蒸发仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；101-1A 电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂溶液制备

肌醇标准溶液：将肌醇标准物质于100 ℃的电热鼓风干燥箱中干燥4 h，准确称量0.052 05 g 于100 mL 容量瓶中，以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，配成0.520 5 mg/mL 肌醇溶液。

硅烷化试剂：分别量取一定量的三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷、二甲基甲酰胺，以1 ∶2 ∶8 的体积比混合，现配现用。

1.3.2 供试品溶液制备

准确量取乐虎试样2.0 mL 于三角瓶中，加入70%的乙醇溶液，使其含肌醇浓度为0.5 mg/mL，超声波提取10 min 后，在3 000 r/min 的条件下离心5 min，取出上清液备用。

准确量取1.0 mL 试样上清液于旋蒸瓶中，加入5 mL 无水乙醇，于60 ℃下旋蒸浓缩至近干，反复3 次，直至旋蒸瓶中液体完全除去。之后再向旋蒸瓶中加入5.0 mL 硅烷化试剂，使用超声波提取器混匀瓶中内容物。再置于70 ℃水浴中加热10 min，静置待其冷却后加入10 mL 纯化水，再加入3.0 mL 正己烷，振摇1 min 后静置10 min，在3 000 r/min 下离心5 min，以滴管取出正己烷层，加入少许无水硫酸钠，小幅度振摇后放置，取上清液上机待测。

1.3.3 标准系列制备

分别吸取0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL 和4.0 mL 浓度为0.520 5 mg/mL 的肌醇标准溶液于5 个10 mL 容量瓶中，以70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，配成浓度为0.010 41 mg/mL、0.020 82 mg/mL、0.052 10 mg/mL、0.104 10 mg/mL 和0.208 20 mg/mL的肌醇标准系列溶液。

准确量取1.0 mL 上述肌醇标准系列溶液于旋蒸瓶中，按1.3.2 中步骤操作，得到肌醇标准衍生溶液，上机待测。

1.3.4 气相色谱条件

色 谱 柱：BP-5 毛 细 管 柱（25 m×0.32 mm，0.25 µm）；柱温：恒温190 ℃；进样口温度：245 ℃；进样方式：分流进样，分流比为1 ∶50；进样量：1 µL；载气：高纯氮，流速为50 mL/min；检测器：FID，空气流量500 mL/min，氢气流量40 mL/min，尾吹气N2流量50 mL/min；色谱峰保留时间定性，峰面积外标法定量。

2 结果与分析

2.1 色谱分离分析

在1.3.4 色谱条件下，28 min 内能完成标准溶液与供试品溶液中肌醇的在线分析，标准溶液的色谱图如图1，肌醇色谱峰尖锐对称，与溶剂峰、杂质峰能较好地分离，可以准确地进行分析检测。

图1 肌醇标准溶液色谱图

2.2 前处理条件探讨

2.2.1 水分对实验的影响

向两份乐虎饮料中添加相同含量的肌醇标准溶液，其中一份在旋蒸过程中水分挥发不完全，另一份完全蒸干水分，测定比较两者的回收率，考察实验中水分的完全除去与否对测定结果的影响。结果显示，旋转蒸发过程中水分未完全挥发的回收率为84.5%，水分挥发完全的回收率为100.1%，表明前处理中水分的完全除去与否对实验回收率影响较大。原因可能是当旋蒸过程中水分挥发不完全，部分肌醇溶于水中未被提取出来，因此实验过程中应确保烘干水分，可在旋转蒸发后再将三角瓶放入烘箱中在75 ℃下烘干1 ～2 h，确保试样中不含水分。

2.2.2 乙醇浓度对实验的影响

向两份乐虎饮料中添加相同含量的肌醇标准溶液，其中一份在旋转蒸发时使用无水乙醇，另一份使用95%乙醇，测定比较两者的回收率，考察实验中乙醇浓度对测定结果的影响。结果显示，旋蒸过程中使用无水乙醇时回收率为102.6%，使用95%乙醇时回收率为99.6%，均在国家标准GB/T 27404—2008[6]要求的95%～105%范围内，表明旋转蒸发过程中所用乙醇的浓度对实验结果影响并不大。

2.3 线性关系与检出限

将肌醇标准系列溶液分别进样于气相色谱仪中，测定相对应的峰面积，以峰面积为y轴，以进样浓度为x轴，绘制标准曲线，计算出线性回归方程为y=1 615 898x-2 159，相关系数r=1，表明肌醇在0.010 41 ～0.208 2 mg/mL 呈现良好线性关系。吸取0.01 mL 2.2.2 中的乐虎饮料加标溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，以气相色谱进样量5 µL作为检测限，进样量10 µL 作为定量限，测得该方法的检出限为0.20 µg/mL，定量限为0.98 µg/mL。

2.4 加标回收率与重复性

准确称取18 份0.25 g 的乐虎饮料试样（经本方法测得肌醇本底含量为0.098 mg）平均分为3 份，按照低、中、高3 种浓度水平分别加入0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 浓度为0.8 µg/mL 的肌醇标准中间液，按照1.3 实验方法将每种浓度水平进行6 平行测试，计算方法的回收率与重复性RSD，结果见表1。乐虎饮料试样中肌醇在0.083 3 ～0.124 9 mg 添加水平下，回收率在96.0%～104.7%，重复性RSD为1.37%～2.67%，表明本方法准确度与重复性较好。

表1 肌醇的加标回收率与重复性实验结果

2.5 方法的稳定性考察

将浓度为53.865 ng/mL 的肌醇标准衍生溶液分别于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 时按照1.3.4色谱条件进行在线分析，考察方法的稳定性，测得峰面积（uV·min）分别为10 905、10 728、11 221、11 256、11 329 和11 533，计算相对标准偏差为2.63%，表明肌醇衍生待测液在36 h 内基本稳定，可以满足多批次处理、仪器连续进样的需求。

3 结论

本研究对国家标准GB 5009.196—2003 中肌醇含量的测定方法进行了验证，并探讨了旋转蒸发过程中水分挥发程度及乙醇浓度对实验结果的影响。结果表明，旋蒸过程中水分必须完全除去，而乙醇浓度对实验结果影响不大。通过对方法的线性关系、检出限、定量限、加标回收率、重复性及稳定性进行考察，该方法符合GB 5009.196—2003 与GB/T 27404—2008 中的相关要求，可以满足当前食品检测实验室高通量、快速、准确的检测需求。